李思蒙，金敏蓉，趙森淼

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

芫花藥材中芫花酯甲和芫花酯乙UPLC-MS含量測(cè)定方法△

李思蒙1，2*，金敏蓉2，趙森淼2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

目的：對(duì)芫花藥材中含量較低的毒效成分芫花酯甲和芫花酯乙建立相關(guān)含量測(cè)定方法，為芫花的臨床使用安全性及進(jìn)一步研究提供參考。方法：采用UPLC-MS，選擇離子掃描法建立相關(guān)檢測(cè)方法。結(jié)果：建立了芫花藥材中芫花酯甲和芫花酯乙含量測(cè)定方法，得到芫花酯甲的線性回歸方程為Y=10.48X+1 234，r=0.998，芫花酯乙的線性回歸方程為Y=10.92X+1 997，r=0.995。結(jié)論：所建立的芫花藥材UPLC-MS含量測(cè)定方法靈敏性高，操作簡(jiǎn)便，耐用性好，測(cè)定結(jié)果可靠，能較好地測(cè)定芫花藥材中微量二萜類成分。

芫花；芫花酯甲；芫花酯乙；含量測(cè)定；UPLC-MS

芫花為瑞香科植物芫花DaphnegenkwaSieb.et Zucc.的干燥花蕾[1]?！侗静菥V目》記載芫花有催生去胎作用[2]。近代臨床主要運(yùn)用該藥進(jìn)行引產(chǎn)、抗早孕以及治療多種疑難病癥，如惡性腫瘤、腹水、精神病等[3-5]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于芫花化學(xué)成分的研究報(bào)道主要包括黃酮、瑞香烷型二萜[6]、木脂素、香豆素類等化合物；生物活性方面的報(bào)道主要集中在抗腫瘤作用以及抗人類免疫缺陷病毒(HIV)等。瑞香烷型二萜類成分是目前國(guó)際研究的熱點(diǎn)成分，也是芫花藥材中的主要毒效成分，既具有較強(qiáng)的生物活性，同時(shí)亦容易引起致敏性反應(yīng)。由于二萜類成分含量普遍很低，臨床用藥中又要注意避免其帶來(lái)的副作用。為了完善芫花藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用芫花藥材，提高臨床用藥的安全性，本文采用UPLC-MS技術(shù)建立芫花中瑞香烷型二萜芫花酯甲和芫花酯乙的含量測(cè)定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ZQ 2000；METTLER 200型電子天平。

1.2 材料

11批芫花藥材收集自全國(guó)各地，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所吳立宏副研究員鑒定為瑞香科瑞香屬植物芫花DaphnegenkwaSieb.et Zucc.的干燥花蕾，樣品憑證保存于上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心。

芫花酯甲、芫花酯乙(上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，純度>98%)，甲醇為分析醇，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)(0.1%冰醋酸水溶液)；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40 ℃，洗脫程序：0～5 min，85%～50% B；5.1～8 min，20% B；8.1～10 min，5% B。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI系統(tǒng)條件參數(shù)設(shè)置：檢測(cè)器為ZQ(正離子模式下選擇芫花酯甲m/z649.6和芫花酯乙m/z587.6)；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；離子源溫度為110 ℃；脫溶劑溫度為300 ℃；脫溶劑氣流量為650 L·h-1。對(duì)照品及樣品離子色譜圖見(jiàn)圖1～3。

2.3 對(duì)照品與供試品溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取芫花酯甲和芫花酯乙對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含芫花酯甲和芫花酯乙各50 ng的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 取芫花中粉0.25 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 檢測(cè)限與定量限

2.4.1.1 檢測(cè)限 按信噪比(S/N)為3時(shí)計(jì)算，確定芫花酯甲的檢測(cè)限為0.000 7 ng，芫花酯乙的檢測(cè)限為0.000 8 ng。

圖1 芫花酯甲和芫花酯乙對(duì)照品離子色譜圖

圖2 樣品中芫花酯甲和芫花酯乙選擇離子色譜圖

圖3 芫花樣品離子全掃色譜圖

2.4.1.2 定量限 按信噪比(S/N)為10時(shí)計(jì)算，重復(fù)測(cè)量5次求得平均值，確定芫花酯甲的定量限為0.002 3 ng，芫花酯乙的定量限為0.002 3 ng。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取芫花酯甲和芫花酯乙適量，吸取甲醇配成不同濃度的對(duì)照品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到芫花酯甲的線性回歸方程為Y=10.48X+1 234，r=0.998；芫花酯乙的線性回歸方程為Y=10.92X+1 997，r=0.995。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取同一對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣7次，測(cè)定芫花酯甲和芫花酯乙的峰面積，計(jì)算RSD分別為3.1%和1.8%。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品6份，精密稱定，按2.3.2操作，在2.1色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)所得芫花酯甲和芫花酯乙的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算RSD分別為2.4%和1.4%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取芫花藥材中粉0.25 g，精密稱定，按2.3.2操作，在2.1色譜條件下，分別在0，1，2，4，8，12，24，36，48，72 h進(jìn)行測(cè)定，以峰面積進(jìn)行考察，計(jì)算RSD=3.4%，結(jié)果表明樣品在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知芫花酯甲和芫花酯乙含量的芫花藥材中粉0.125 g(芫花酯甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.11 mg·g-1，芫花酯乙質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.37 mg·g-1)，精密稱定9份，每3份加入相同量(分別為已知含量的50%，100%，150%)的芫花酯甲和芫花酯乙的對(duì)照品，按2.3.2方法操作，測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 芫花中芫花酯甲加樣回收率測(cè)定

表2 芫花中芫花酯乙加樣回收率測(cè)定

2.5 含量測(cè)定

分別取芫花中粉0.25 g，精密稱定，按2.3.2操作，制成供試品溶液。精密稱取芫花酯甲、芫花酯乙對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含芫花酯甲、芫花酯乙各50 ng的溶液，即得。分別精密吸取對(duì)照品溶液1 μL，供試品溶液5 μL，注入U(xiǎn)PLC-MS，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 芫花樣品中芫花酯甲和芫花酯乙的測(cè)定(n=3) mg·g-1

3 討論

流動(dòng)相的選擇分別考察了乙腈-水，乙腈-0.01%醋酸水溶液，水溶液在加入醋酸后對(duì)色譜峰的對(duì)稱性有明顯改善，則選用乙腈-0.01%醋酸水溶液作為流動(dòng)相。

芫花酯甲和芫花酯乙是芫花抗腫瘤、抗HIV作用的主要活性成分，也是芫花致敏性的主要成分。本文選擇這兩個(gè)成分作為芫花UPLC-MS含量測(cè)定的指標(biāo)成分，能夠較好地指示出芫花中毒效成分的含量，對(duì)于臨床用藥的安全性以及對(duì)芫花的深入研究都有著重要意義，同時(shí)可以完善芫花藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的認(rèn)定。《中國(guó)藥典》2010版以及其他相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)都是以黃酮類物質(zhì)芫花素、羥基芫花素作為芫花的指標(biāo)成分進(jìn)行考察，這兩類黃酮類物質(zhì)主要起到鎮(zhèn)咳祛痰的作用。經(jīng)文獻(xiàn)研究芫花的傳統(tǒng)藥用物質(zhì)基礎(chǔ)主要為瑞香烷型二萜類成分，故采用芫花酯甲和芫花酯乙這兩個(gè)二萜類物質(zhì)中含量較高的成分為代表，能夠較好地反映出芫花藥材的質(zhì)量?jī)?yōu)劣，從而保證芫花藥材的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)研究建立的芫花藥材UPLC-MS含量測(cè)定方法靈敏性高，操作簡(jiǎn)便，耐用性好，測(cè)定結(jié)果可靠，能較好地測(cè)定芫花藥材中的微量二萜類成分，可用于芫花藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)，中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：148.

[2] 李時(shí)珍，本草綱目 [M].第二冊(cè).北京：人民衛(wèi)生出版社，1979：121.

[3] Kasai R，Lee K H，Huang H C,et al.Genkwadaphnin，a potent antileukemic diterpene fromDaphnegenkwa[J].Phytochemistry，1981，20(11)：2592-2594.

[4] Hall I H，Kasai R，Wu R Y，et al.Antitumor agents LV：Effects of genkwadaphnin and yuanhuacine on nucleic acid synthesis of P-388 lymphocytic leukemia cells，Pharm[J].Sci，1982，71(11)：1263-1267.

[5] Zhan Z J，F(xiàn)an C Q，Ding J，et al.Novel diterpenoids with potent inhibitory activity against endothelium cell HMEC and cytotoxic activities form a well-known TCM plantDaphnegenkwa[J].Bioorga Med Chem，2005，13：645-655.

[6] Li S M，Chou G X，Hseu Y C,et al.Isolation of anticancer constituents from Flos Genkwa(DaphnegenkwaSieb.et Zucc.)through bioassay-guided procedures[J].Chemistry Central Journal，2013，7：159.

DeterminationofYuanhuacineandYuanhuadineinDaphnegenkwaSieb.etZucc.byUPLC-MS

LI Simeng1，2*，JINMinrong2，ZHAOSenmiao2

(1.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.ShanghaiUniversityofChineseMedicine，Shanghai，201203，China)

Objective：To establish qualitative analysis method for yuanhuacine and yuanhuadine，and to provide the reference for the clinical safety of the medicinal material ofDaphnegenkwa.Methods：The qualitative analysis method was established by UPLC-MS and ion scanning method.Results：The qualitative analysis methods was established for determining yuanhuacine and yuanhuadine.The linear regression equation of yuanhuacine wasY=10.48X+1 234，r=0.998，and the linear regression equation of yuanhuadine wasY=10.92X+1 997，r=0.995.Conclusion：The qualitative analysis forD.genkwaby UPLC-MS was high sensitive，easy and simple to handle，good durability and reliable，which was able to determine the diterpenoids for medicinal material ofD.genkwa.

Daphnegenkwa；Yuanhuacine；Yuanhuadine；Qualitative analysis；UPLC-MS

2014-10-24)

常用有毒中藥質(zhì)量控制方法和安全標(biāo)準(zhǔn)研究(09dZ1972800)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

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李思蒙，講師，研究方向：中藥化學(xué)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Tel：(025)85811514，E-mail：lisimeng0626@hotmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.008