陳 靜，周 園，鄭 磊，王 前，蔡 貞

0 引 言

Maspin廣泛表達于人體組織，是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族中clade B亞家族的一員，但結(jié)構(gòu)特點提示其可能并不具有蛋白酶抑制功能［1］。1994年Zou等［2］首次報道了maspin具有腫瘤抑制基因的功能，并發(fā)現(xiàn)其在正常乳腺上皮細胞中高表達，而在具有侵襲和轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細胞中表達下調(diào);用maspin轉(zhuǎn)染MDA-MB-435乳腺癌細胞株后，可降低癌細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力，減弱其穿透基底膜及轉(zhuǎn)移能力。隨后，maspin被相繼報道在多種惡性腫瘤中表達下調(diào)或缺失，包括前列腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、口腔鱗狀上皮癌等，并與腫瘤分期、腫瘤大小、患者對治療的反應(yīng)性及預(yù)后、腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有相關(guān)性［3－5］。

前期的研究我們發(fā)現(xiàn)maspin在食管癌組織中的表達較正常食管上皮組織明顯減低;在用食管癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)構(gòu)建的異體移植腫瘤中maspin的表達進一步下調(diào)甚至缺失，這一結(jié)果得到證實［6］。后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染maspin的EC109食道癌細胞未出現(xiàn)EGF誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，并且穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的惡性表型也發(fā)生了逆轉(zhuǎn)［7］。為進一步研究maspin的作用機制，本研究擬采用慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)技術(shù)構(gòu)建maspin表達敲減的食管癌細胞株，作為后續(xù)研究maspin功能及其影響食道癌發(fā)生發(fā)展的分子機制的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 慢病毒載體質(zhì)粒pLL3.7由香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院生化系金冬雁教授贈送;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒購自TaKaRa公司;T4 DNA連接酶及XbaⅠ/XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs公司;質(zhì)粒抽提、凝膠回收與純化試劑盒購自Qiagen公司;DNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Life Technologies;鼠抗人maspin單克隆抗體及β-actin單克隆抗體(AC-15)分別購自BD Biosciences及Sigma公司;嘌呤霉素及其他化學(xué)試劑購自 Sigma公司;U6-XbaⅠ-F，shMaspin-1和shMaspin-2寡核苷酸序列由Sigma公司合成;所有溶液均用MilliQ級超純水配制。

1.2 細胞培養(yǎng) 人ESCC HKESC-2細胞來源于1名香港女性患者［8］;用于慢病毒包裝的人胚腎細胞(293FT)由香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院生化系金冬雁教授贈送。HKESC-2和293FT細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。所有細胞培養(yǎng)所需試劑購自Life Technologies公司。

1.3 構(gòu)建shMaspin慢病毒表達載體 以人maspin編碼序列(NM_002639.4)為模板，按照 RNAi序列設(shè)計原則，利用Darmacon siDESIGN Center軟件設(shè)計特異的siRNA序列。最終確定2個序列合成shRNA寡核苷酸序列(GCACAAGGATGAATTGAAT和 GCTTAGAAATAACTGAAGA)，并于 5'端加入XhoⅠ酶切位點，以此序列作為后續(xù)PCR擴增的下游引物，合成序列如圖1。以pLL3.7載體為模板，帶有XbaⅠ位點的U6-XbaⅠ-F寡核苷酸序列作為上游引物(5'-CCCGCTCTAGAAGGTCGGGCAGGAAGAGGG-3')，U6-XhoⅠ-R1(shMaspin1)及 U6-XhoⅠ-R2(shMaspin2)為下游引物進行PCR擴增。擴增條件為95℃ 5min，1個循環(huán);95℃ 30s，55℃ 30 s，72℃ 30 s 30個循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物回收純化后經(jīng)XbaⅠ/XhoⅠ雙酶切，用T4 DNA連接酶將shMaspin PCR產(chǎn)物連接至同步經(jīng)XbaⅠ/XhoⅠ消化的帶有U6啟動子的pLL3.7慢病毒載體中，室溫連接2 h后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，次日挑選陽性克隆進行酶切分析及DNA序列測定。

1.4 病毒包裝 病毒包裝步驟參照文獻［9］。將293FT細胞傳代至6孔細胞培養(yǎng)板中至細胞密度生長至70%左右，實驗前2 h每孔更換為1 mL無血清DMEM培養(yǎng)基待用。取3個微量離心管，每管加入無血清DMEM培養(yǎng)基500 μL，分別加入慢病毒表達質(zhì)粒 shMas1/pLL3.7、shMas2/pLL3.7 和 pLL3.7 空質(zhì)粒0.8 μg，然后在離心管中加入1.2 μg病毒包裝質(zhì)?；旌衔?pLP1/gag pol、pLP2/REV及pLP/VSVG)和6 μL Lipofectamine 2000，輕輕混勻。靜置20 min后分別加入293FT細胞中，培養(yǎng)24 h后更換含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)液上清，5000 r/min離心5 min去除細胞碎片，上清以0.22 μm過濾后置－80℃冰箱保存待用。

1.5 HKESC-2細胞感染及篩選 感染前24 h，將HKESC-2細胞以5×104/孔接種于6孔培養(yǎng)板，至次日生長至密度為70%左右時進行感染。在不同孔內(nèi)分別加入重組病毒感染細胞24h后，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入嘌呤霉素篩選感染細胞。不同細胞株對嘌呤霉素的耐受性不同，將未經(jīng)感染的對照組細胞懸浮死亡的最低濃度作為最佳的篩選濃度。測定3、2、1、0.5 μg/mL 的嘌呤霉素濃度對 HKESC-2 細胞生長的影響，最終確定以1 μg/mL為篩選濃度，篩選后獲得的穩(wěn)定細胞株分別命名為shMas1/HK2、shMas2/HK2，空病毒載體感染細胞株作為陰性對照。

圖1 shMas 1和shMas 2寡核苷酸序列設(shè)計Figure 1 Oligonucleotide primer design of shMas 1 and shMas 2

1.6 熒光定量 PCR 收集 shMas1/HK2、shMas2/HK2、野生型HKESC-2及陰性對照(空病毒載體感染細胞)對數(shù)生長期細胞，Trizol提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進行qPCR分析。maspin正向引物:5'-ATCAAGCTTCGGATGCCCCTGCAACTAGCAAATTC-3'，反向引物，3'-GGGATTGAATTCTTAAGGAGAACAFAATTTGCC-5';內(nèi)參基因 β-actin正向引物:5'-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3'，反向引物5'-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3'。采用 2－△△CT法計算原始CT值數(shù)據(jù)。

1.7 Western blot分析 等量蛋白用12%SDSPAGE凝膠進行分離。電泳后利用電轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂奶粉孵育PVDF膜2 h后，加入特異性抗體在室溫下孵育2 h，再以過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育，最后用ECL檢測免疫印跡。

1.8 細胞生長計數(shù)分析 將shMas1/HK2、shMas2/HK2、空載體株陰性對照(Negative control，NC)及野生型HKESC-2細胞以0.5×104/mL的密度分別鋪種于24孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2條件培養(yǎng)，每24 h各細胞株取3孔進行常規(guī)計數(shù)，余孔定期換液維持培養(yǎng)。連續(xù)計數(shù)8 d。以3孔的平均值作為各組在該時間點的細胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差()表示，用雙側(cè)t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 shMaspin慢病毒表達載體鑒定 PCR擴增shMaspin片段和pLL3.7慢病毒載體經(jīng)XbaⅠ/XhoⅠ充分酶解消化，再經(jīng)低濃度瓊脂凝膠回收純化后，用T4 DNA連接酶于室溫連接2 h后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)宿主，挑選陽性克隆進行鑒定。重組陽性克隆的產(chǎn)物為287bp，表示shRNA已經(jīng)定向連接入pLL3.7載體。選取連接成功的克隆進行測序分析，測序結(jié)果表明插入序列正確，見圖2。

2.2 HKESC-2細胞中maspin基因敲減效率的檢測 Maspin shRNA慢病毒顆粒感染HKESC-2細胞獲得穩(wěn)定細胞株后，以熒光定量PCR檢測maspin基因mRNA表達水平的改變。3次獨立實驗數(shù)據(jù)表明，與野生型HKESC-2及空載體感染 NC細胞相比，shMas1/HK2及 shMas2/HK2中 maspin mRNA的水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，下調(diào)率即敲減效率分別為37.8%及58.2%。Western blot檢測蛋白水平的改變時也得到了相近的結(jié)果，通過對顯影后蛋白質(zhì)條帶做密度分析，并以β-actin校正后，計算得shMas1/HK2和shMas2/HK2細胞maspin蛋白質(zhì)水平表達的相對抑制率分別為49%和53%。見圖3。

2.3 shMaspin穩(wěn)定表達對HKESC-2細胞生長的影響 利用重組慢病毒感染HKESC-2細胞并篩選出穩(wěn)定細胞株shMas1/HK2、shMas2/HK2及空載體株陰性對照，細胞穩(wěn)定傳代5次后，觀察各細胞形態(tài)無明顯變化。以常規(guī)細胞計數(shù)法計數(shù)細胞生長，maspin敲減組(shMas1/HK2、shMas2/HK2)及對照組(野生型HKESC-2、空載體轉(zhuǎn)染株陰性對照NC)細胞生長速率相比無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖4。但至細胞生長至第7天，細胞密度大于2 ×105個/mL后，第8 天shMas1/HK2、shMas2/HK2較HKESC-2、NC細胞生長明顯增快(均值分別為3.33 × 105/mL、3.75 × 105/mL、2.31 × 105/mL 和2.39×105/mL)。單純比較第8天，2組細胞計數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014)，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示maspin表達降低可能對細胞在高密度狀態(tài)下生長有一定影響。

圖2 shMaspin慢病毒表達載體的鑒定Figure 2 Identification of shMaspin recombinant slow-virus carrier by enzyme cleavage of PCR products and sequencing

圖3 Maspin基因敲減效率檢測Figure 3 Maspin knockdown effection was detected by quantitative real-time PCR and Western blot

圖4 Maspin基因敲減對HKESC-2細胞生長特性的影響Figure 4 The effect of maspin knockdown on cell morphologyand cell growth

3 討 論

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指在生物進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的靶mRNA高效特異性降解，從而導(dǎo)致靶基因表達降低或沉默的現(xiàn)象。這種基因沉默可以作用于多個環(huán)節(jié)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中［10］。慢病毒介導(dǎo)的shRNA技術(shù)是RNAi的主流方法之一，攜帶shRNA的慢病毒載體能將外源基因整合到宿主染色體上，穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄生成shRNA并加工生成siRNA，進而特異性的抑制靶基因的表達［11］。慢病毒載體具有宿主范圍廣、產(chǎn)生病毒滴度高、感染效率高、安全性好、作用持久等優(yōu)點，且允許實現(xiàn)多個shRNA同時作用于不同靶基因，用于多個感興趣基因的研究中能極大地簡化實驗過程［12］。在構(gòu)建重組蛋白、靶基因的過度表達及敲減、基因治療及誘導(dǎo)性多能干細胞的產(chǎn)生等方面有廣泛地應(yīng)用［13］。

本研究利用pLL3.7慢病毒載體系統(tǒng)，將特異性針對maspin的shRNA轉(zhuǎn)入食管癌細胞株HKESC-2中，成功構(gòu)建了maspin表達敲減細胞株(shMas1/HK2和shMas2/HK2)。在目的shRNA序列正確插入pLL3.7慢病毒表達載體的基礎(chǔ)上，重組慢病毒質(zhì)粒能夠?qū)hRNA片段整合到HKESC-2細胞的染色體上。隨細胞分裂增殖，感染細胞將持續(xù)表達 maspin特異性 shRNA，經(jīng)加工后生成siRNA干擾maspin的表達，以此產(chǎn)生穩(wěn)定的maspin低表達細胞株。本研究中獲得的2個穩(wěn)定感染株中，Maspin在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達均明顯減少，達到了較好的干擾效果。

獲得穩(wěn)定感染的maspin表達敲減細胞株后，觀察細胞生長情況發(fā)現(xiàn)，細胞形態(tài)較野生型HKESC-2和空病毒載體感染細胞并無明顯變化;在細胞密度較低的情況下，對細胞生長速率也無明顯影響。但當(dāng)細胞計數(shù)至第8天，細胞密度較高時，maspin敲減細胞系shMas1/HK2和shMas2/HK2生長速率明顯高于其親代細胞HKESC-2及空載體對照NC細胞，提示maspin表達降低可能對細胞在高密度或能量供給缺乏狀態(tài)下的細胞生長有一定影響。腫瘤細胞，尤其是具有高侵襲能力的腫瘤細胞常常失去接觸抑制特性，并且更適合在酸性微環(huán)境中生長和存活［14］。我們前期的實驗發(fā)現(xiàn)，在無血清培養(yǎng)條件下，maspin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的增殖速度比其親代細胞EC109(無maspin表達)慢得多［7］，且伴隨糖酵解表型的轉(zhuǎn)變，提示maspin重新表達可能促使EC109細胞惡性表型發(fā)生了轉(zhuǎn)變，致使其生物學(xué)行為更類似于良性表型細胞［7］。本研究中在細胞生長曲線測定后期(第7～8天)，由于細胞密度很高，細胞生長環(huán)境pH減低，maspin敲減細胞株表現(xiàn)出更強的生長能力。這和之前實驗的現(xiàn)象均表明maspin的表達水平有可能對細胞的惡性表型有一定程度的影響，但其具體機制仍需進一步探討。另有很多研究表明，Maspin在某些腫瘤發(fā)展中可發(fā)揮抗細胞增殖和促進凋亡的作用。有研究對胃癌細胞株進行maspin表達干擾實驗后分析細胞增殖情況和細胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后G0/G1細胞比率明顯降低，而S期細胞比率顯著增加［15］。Maspin可參與細胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子E2F1介導(dǎo)的細胞周期調(diào)控通路，通過抑制周期依賴性激酶1所活化的周期蛋白B(CDC25C)的形成減慢胃癌細胞的增殖速度。然而，由于細胞的增殖和凋亡的調(diào)控機制十分復(fù)雜，同時maspin的功能及與E2F1的作用關(guān)系可能具有腫瘤和組織特異性。因此，將食管癌細胞HKESC-2的maspin表達敲減后，其影響細胞增殖和凋亡的機制尚有待進一步的研究證實。

本實驗成功構(gòu)建了2株maspin表達敲減的穩(wěn)定感染食道癌上皮細胞株(shMas1/HK2和shMas2/HK2)，有助于研究maspin在食管癌的進展和轉(zhuǎn)移過程中的功能，為進一步闡明其作用機制和信號通路以及后續(xù)進行細胞和動物研究打下了良好的基礎(chǔ)。

［1］Khalkhali-Ellis Z.Maspin:the new frontier［J］.Clin Cancer Res，2006，12(24):7279-7283.

［2］Zou Z，Anisowicz A，Hendrix MJ，et al.Maspin，a serpin with tumor-suppressing activity in human mammary epithelial cells［J］.Science，1994，263(5146):526-529.

［3］Sheng S.The promise and challenge toward the clinical application of maspin in cancer［J］.Front Biosci，2004，9:2733-2745.

［4］Berardi R，Morgese F，Onofri A，et al.Role of maspin in cancer［J］.Clin Transl Med，2013，2(1):8.

［5］Wang Y，Sheng S，Zhang J，et al.Elevated maspin expression is associated with better overall survival in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)［J］.PloS one，2013，8(5):e63581.

［6］蔡 貞，周 園，熊石龍，等.與食道鱗狀上皮細胞癌發(fā)生相關(guān)的細胞骨架及相關(guān)蛋白的篩選鑒定［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2012，12(12):1424-1429.

［7］Cai Z，Zhou Y，Lei T，et al.Mammary serine protease inhibitor inhibits epithelial growth factor-induced epithelial-mesenchymal transition of esophageal carcinoma cells［J］.Cancer，2009，115(1):36-48.

［8］Hu YC，Lam KY，Law SY，et al.Establishment，characterization，karyotyping，and comparative genomic hybridization analysis of HKESC-2 and HKESC-3:two newly established human esophageal squamous cell carcinoma cell lines［J］.Cancer Genet Cytogenet，2002，135(2):120-127.

［9］陳 偉，曹 罡，董 震，等.人Notch4基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2013，26(2):116-121.

［10］Hannon GJ.RNA interference［J］.Nature，2002，418(6894):244-251.

［11］李 麗，王長山，吳玉斌.PAX2小干擾RNA在UUO大鼠體內(nèi)的篩選與鑒定［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2012，25(7):678-684.

［12］Manjunath N，Wu H，Subramanya S，et al.Lentiviral delivery of short hairpin RNAs［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61(9):732-745.

［13］Picanco-Castro V，de Sousa Russo-Carbolante EM，Tadeu Covas D.Advances in lentiviral vectors:a patent review［J］.Recent Pat DNA Gene Seq，2012，6(2):82-90.

［14］Hanahan D，Weinberg RA.The hallmarks of cancer［J］.Cell，2000，100(1):57-70.

［15］Kim M，Ju H，Lim B，et al.Maspin genetically and functionally associates with gastric cancer by regulating cell cycle progression［J］.Carcinogenesis，2012，33(12):2344-2350.