蘇云術(shù)，徐利軍，周鴻敏，Alfred Omo，魏 翔

0 引 言

生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)是腫瘤學(xué)重要的研究?jī)?nèi)容之一，現(xiàn)有的各種腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)方法存在諸多缺陷?；铙w成像技術(shù)(in vivo imaging technique，IVIT)是近年來(lái)發(fā)展的一種追蹤活性細(xì)胞的新技術(shù)，本研究以此監(jiān)測(cè)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，取得了良好的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí) Balb/C雄性小鼠，體重15～20 g，5～7周齡，常規(guī)飼養(yǎng)，由同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):42000500001288。RPMI1640培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品;小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞株(B16-F10-luc-G5，標(biāo)記有螢火蟲(chóng)熒光素酶luc基因)、螢火蟲(chóng)熒光素鉀鹽(D-Luciferin，F(xiàn)irefly)和活體成像系統(tǒng)(in vivo imaging system，IVIS)Lumina為美國(guó)Xenogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10-luc-G5復(fù)蘇后，以含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素(分別稀釋到50 000 U/mL后再混合)的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2飽和濕度環(huán)境常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.2.2 小鼠皮下腫瘤模型建立 Babl/C小鼠18只，在其右側(cè)背部近大腿處以1 mL注射器注射1×106/mL B16-F10-luc-G5細(xì)胞100 μL(細(xì)胞數(shù)1×105個(gè))于皮下，建立皮下腫瘤模型。

1.2.3 常規(guī)方法觀察腫瘤的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài) 腫瘤接種后，每天觸摸及目測(cè)接種部位，待腫塊可觸及時(shí)記為腫瘤出現(xiàn)時(shí)間。腫瘤生長(zhǎng)速度以其逐日測(cè)定的體積計(jì)算:每次取3只小鼠，用游標(biāo)千分尺記錄腫瘤最長(zhǎng)徑(L)和垂直方向最大橫徑(W)，最終計(jì)算腫瘤體積的均值，腫瘤體積(V)計(jì)算公式:

V=LW2/2

1.2.4 IVIS 監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài) 于第 0、3、5、7、9、14天以IVIS檢測(cè)移植瘤的生物發(fā)光，每次取3只小鼠，檢測(cè)前每只小鼠全身麻醉(系統(tǒng)自帶吸入麻醉機(jī)吸入麻醉)，按10 μL/g腹腔注入 15 mg/mL D-Luciferin后120 s顯像。曝光條件:10 bin、視野15、60 s。最終獲得腫瘤生物發(fā)光的均值。

1.2.5 移植瘤病理學(xué)檢查 第3、5、7、9、14 天 IVIS檢測(cè)移植瘤的生物發(fā)光后，3只小鼠處死，取腫瘤組織觀察及按常規(guī)制成石蠟切片，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，自身前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，一元線性回歸方程確定變量之間回歸關(guān)系。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 移植瘤病理學(xué)檢查 小鼠背部接種的局部皮膚未見(jiàn)變化。局部隆起出現(xiàn)后，解剖見(jiàn)黑色整塊瘤體組織周?chē)粚臃票　⒐饬恋闹旅馨?，和正常組織間界限明顯，整塊瘤體由數(shù)個(gè)小瘤體組成，每個(gè)小瘤體均有獨(dú)立包膜，整個(gè)腫瘤出現(xiàn)復(fù)層包膜，符合B16黑色素瘤典型的生長(zhǎng)特點(diǎn)。腫瘤生長(zhǎng)后期該特征更為明顯，見(jiàn)圖1。組織病理切片見(jiàn)腫瘤細(xì)胞周?chē)馨图?xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2。

圖1 B16F10移植瘤局部表現(xiàn)Figure 1 Local appearance of B16F10 inoculated tumor

圖2 B16F10移植瘤病理切片(HE ×400)Figure 2 Pathohistology of B16F10 inoculated tumor(HE×400)

圖3 小鼠B16F10移植瘤第7天的目測(cè)情況和生物發(fā)光Figure 3 Anatomical size and bioluminescence of the same inoculated tumor in Day 7

2.2 常規(guī)方法觀察腫瘤的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài) B16-F10-G5在Babl/C小鼠的成瘤率均為100%;平均腫瘤出現(xiàn)時(shí)間為(6.1±0.8)d。接種后3 d內(nèi)，種植瘤體積無(wú)法目測(cè)，直到第5天方可目測(cè)，第7天腫瘤體積約為4 mm ×2 mm ×1 mm，見(jiàn)圖1a。第5、7、9、14天腫瘤大小分別為［(2.86E+00)±1.21］、［(4.87E+00)±1.66］、［(9.27E+01)±6.31］、［(2.60E+02)±7.88］mm3。

2.3 IVIS監(jiān)測(cè)腫瘤模型的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果 在第0天以IVIS即可觀察到腫瘤生物發(fā)光(此時(shí)肉眼無(wú)法觀察);第0、3、5、7、9、14 天腫瘤平均實(shí)測(cè)光子數(shù)為［(6.35E+05)± 7655］、［(1.12E+05)±1820］、［(1.62E+05)± 2090］、［(2.40E+05)±3515］、［(1.18E+06)±11 530］、［(2.23E+06)±17934］photon/(cm2·ser·s)。第 3 天腫瘤生物發(fā)光(實(shí)測(cè)平均光子數(shù))少于第0天(P＜0.05)。隨著時(shí)間推移，后期發(fā)光值增加明顯;以IVIS監(jiān)測(cè)結(jié)果繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，曲線呈現(xiàn)類(lèi)似倒置拋物線形特點(diǎn)。移植瘤生物發(fā)光與解剖大小的對(duì)應(yīng)關(guān)系以第7天為例。見(jiàn)圖3。

2.4 移植瘤的生物發(fā)光與體積關(guān)系分析 第5天后移植瘤平均實(shí)測(cè)光子數(shù)與體積之間存在線性回歸關(guān)系，公式與相關(guān)系數(shù)分別為:Y=7 939.3X+237 606，R2=0.97。見(jiàn)圖4。

圖4 以生物發(fā)光檢測(cè)結(jié)果繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線Figure 4 Curve of tumor growth continuously monitored by IVIS

3 討 論

腫瘤學(xué)的研究中，對(duì)于腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和治療效果的探討常涉及到腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)?，F(xiàn)有腫瘤模型生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)方法較少，常見(jiàn)有目測(cè)(包括解剖)和影像學(xué)檢查(如動(dòng)物CT)，但這些方法共同的缺點(diǎn)是檢測(cè)的敏感性和特異性較差，故對(duì)此需要尋找新的方法［1－2］。

IVIT是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種示蹤技術(shù)［3］，其原理是先將光學(xué)報(bào)告基因，如熒光素酶(Luciferase)等標(biāo)記到待研究對(duì)象(如細(xì)胞)染色體中，光學(xué)報(bào)告基因產(chǎn)物，如熒光素酶等與發(fā)光底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光或激發(fā)產(chǎn)生熒光，通過(guò)檢測(cè)生物發(fā)光或激發(fā)熒光即可追蹤該對(duì)象。在光學(xué)報(bào)告基因的選擇上，對(duì)于量化實(shí)驗(yàn)，尤其在細(xì)胞的定量示蹤方面，一般選擇熒光素酶而非綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因標(biāo)記，因GFP為激發(fā)熒光而無(wú)法定量，而熒光素酶催化的生物發(fā)光與標(biāo)記對(duì)象呈線性相關(guān)且可量化研究。熒光素酶是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱(chēng)，見(jiàn)于發(fā)光真菌、海星、節(jié)蟲(chóng)、魚(yú)和甲蟲(chóng)。研究中最常標(biāo)記用的熒光素酶基因有3種，按照來(lái)源及特性分別為FLUC基因，來(lái)源于北美螢火蟲(chóng)，大小550aa，發(fā)光波長(zhǎng)562 nm，發(fā)光底物為熒光素，發(fā)光依賴于三磷酸腺苷(adejosine triphosphate，ATP);RLUC基因，來(lái)源于海腎，大小311aa，發(fā)光波長(zhǎng)480 nm，底物腔腸素，發(fā)光不依賴于ATP;GLUC基因，來(lái)源于古西亞蟲(chóng)屬，大小185aa，發(fā)光波長(zhǎng)480 nm，發(fā)光底物腔腸素，發(fā)光不依賴于ATP。其中，F(xiàn)LUC常被選作報(bào)告基因，其優(yōu)勢(shì)包括:①內(nèi)源性低，哺乳動(dòng)物無(wú)內(nèi)源性表達(dá)，外源性熒光素酶基因標(biāo)記方法簡(jiǎn)單易行，且可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)［4－6］，對(duì)宿主細(xì)胞生物特征影響小;②熒光素酶檢測(cè)不受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)影響;③利用發(fā)光檢測(cè)，檢測(cè)方便;④靈敏度高，僅需10－20mol熒光素酶分子;⑤檢測(cè)范圍廣，可大于7個(gè)數(shù)量級(jí)。IVIS即利用IVIT，將非常靈敏的檢測(cè)元件組合成整套儀器，從而提供了一個(gè)高靈敏性的IVIT示蹤平臺(tái)。IVIT及IVIS已廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、病毒學(xué)、干細(xì)胞、移植免疫、蛋白質(zhì)和基因等諸多前沿研究領(lǐng)域［7－10］。本研究的前期工作成功進(jìn)行了IVIS追蹤細(xì)胞的定量研究［11－12］。

但迄今為止，利用IVIT進(jìn)行腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)鮮有報(bào)道［12］。針對(duì)以上問(wèn)題，本研究試圖探討該可行性。研究使用了B16-F10-luc-G5細(xì)胞系(B16為黑色素瘤、Fx為變異系數(shù)、luc為熒光素酶基因、G5為加壓傳代編號(hào))，即標(biāo)記有熒光素酶基因(FLUC)的小鼠黑色素瘤細(xì)胞。該FLUC基因在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，編碼產(chǎn)物熒光素酶數(shù)目恒定［6］。故理論上利用IVIT捕捉生物發(fā)光不但可追蹤該FLUC基因標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，還有可以通過(guò)光子數(shù)推算細(xì)胞的數(shù)目(量化研究)。結(jié)合前期研究，本研究驗(yàn)證了此假設(shè)。本研究發(fā)現(xiàn)，IVIT連續(xù)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)具有可行性，與其他方法相比，其優(yōu)點(diǎn)在于:①高度靈敏。在肉眼無(wú)法觀察到的腫瘤生長(zhǎng)早期，甚至剛植入腫瘤細(xì)胞時(shí)，IVIT即可監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)。而此時(shí)腫塊太小，尚無(wú)法用其他方法測(cè)量。②量化的結(jié)果更具可比性。IVIT測(cè)定的結(jié)果為光子數(shù)，計(jì)量單位大于7個(gè)數(shù)量級(jí)，比包括影像學(xué)測(cè)定腫瘤體積的方法更為方便。且光子數(shù)的檢測(cè)結(jié)果不受腫瘤外形的影響，而影像學(xué)(如CT等)的檢測(cè)結(jié)果受此影響，一旦腫瘤不規(guī)則則量化困難。③連續(xù)動(dòng)態(tài)。IVIT可在不處死動(dòng)物的情況下直接觀察腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，使實(shí)驗(yàn)具有較好的連續(xù)性，且大大減小了實(shí)驗(yàn)所需的動(dòng)物數(shù)、創(chuàng)傷小。④IVIS無(wú)放射性，對(duì)被監(jiān)測(cè)的細(xì)胞、動(dòng)物及操作者無(wú)害。本研究還發(fā)現(xiàn)以IVIT檢測(cè)結(jié)果繪制的腫瘤生長(zhǎng)曲線，曲線呈倒置拋物線形，這種變化趨勢(shì)反映了移植瘤在宿主體內(nèi)的生長(zhǎng)特點(diǎn)。分析產(chǎn)生此曲線可能的原因在于B16-F10細(xì)胞為C57BL/6小鼠來(lái)源，接種到Babl/C小鼠相當(dāng)于異種移植，接種早期被宿主淋巴細(xì)胞所殺傷(病理圖片檢查證實(shí)淋巴細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞周?chē)?rùn))，但B16-F10有高變異性，很快變異而被宿主耐受而存活、增殖。因此，生長(zhǎng)曲線呈倒置拋物線形提示接種早期腫瘤細(xì)胞因殺傷或?qū)嶒?yàn)操作而較多死亡。后期生長(zhǎng)加速，這種變化其他生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)方法難以觀察到。另外，B16-F10細(xì)胞被FLUC基因標(biāo)記后，其生物特征未見(jiàn)明顯改變，仍呈現(xiàn)典型的黑色素瘤生長(zhǎng)特征。

總之，本研究的結(jié)論認(rèn)為IVIS可連續(xù)、靈敏、精確地監(jiān)測(cè)體內(nèi)外腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，結(jié)果可靠，且可行細(xì)胞定量分析，與其他測(cè)定細(xì)胞活性功能的方法相比存在明顯的優(yōu)勢(shì)，值得推薦。

［1］楊慎敏，溫端改，侯建全，等.原位膀胱癌動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用［J］.癌癥，2007，26(4):341-345.

［2］杜 睿，薛 玉.超聲造影及彈性成像技術(shù)在乳腺腫瘤診斷的現(xiàn)狀與進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(4):435-437.

［3］Massoud TF，Gambhir SS.Molecular imaging in living subjects:seeing fundamental biological processes in a new light［J］.Genes Dev，2003，17(5):545-580.

［4］Hardy J，F(xiàn)rancis KP，Deboer M，et al.Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder［J］.Science，2004，303(5659):851-853.

［5］Greer LF 3rd，Szalay AA.Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms:a review［J］.Luminescence，2002，17(1):43-74.

［6］Ow DW，De Wet JR，Helinski DR，et al.Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants［J］.Science，1986，234(4778):856-859.

［7］Han Z，F(xiàn)u A，Wang H，et al.Noninvasive assessment of Cancer response to therapy［J］.Nat Med，2008，14(3):343-349.

［8］Dentin R，Liu Y，Koo SH，et al.Insulin modulates gluconeogenesis by inhibition of the coactivator TORC2［J］.Nature，2007，449(7160):366-369.

［9］Minn AJ，Gupta GP，Siegel PM，et al.Genes that mediate breast Cancer metastasis to lung［J］.Nature，2005，436(7050):518-524.

［10］Shachaf CM，Kopelman AM，Arvanitis C，et al.MYC inactivation uncovers pluripotent differentiation and tumour dormancy in hepatocellular Cancer［J］.Nature，2004，431(7012):1112-1117.

［11］徐利軍，周鴻敏，陳忠華，等.B16F10黑色素瘤小鼠雙陰性T細(xì)胞變化及腫瘤生長(zhǎng)關(guān)系的研究［J］.中華小兒外科雜志，2009，30(10):710-713.

［12］Zheng J，Xu L，Zhou H，et al.Quantitative analysis of cell tracing by in vivo imaging system［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2010，30(4):541-545.