卜 婧，張永亮，李靈芝，龔海英，李建宇

0 引 言

近年關(guān)于鈣超載在腦缺血所致腦損傷中的作用越來(lái)越受到重視，被認(rèn)為是誘發(fā)神經(jīng)元變性和死亡的關(guān)鍵因素［1］。研究顯示當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí)，神經(jīng)元細(xì)胞缺氧、缺糖導(dǎo)致能量不足，破壞了維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的平衡機(jī)制，使缺氧細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度(［Ca2+］i)大幅度增加，觸發(fā)鈣依賴(lài)的下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起一系列病理?yè)p傷，造成腦功能缺失［2］。因此，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載成為新藥研發(fā)的重要靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)蕨麻正丁醇部位(n-butanol extract of Potentilla anserina L，NP)對(duì)因缺氧導(dǎo)致的機(jī)體損傷具有保護(hù)作用，是其抗缺氧的活性部位［3－4］。研究發(fā)現(xiàn)其具有抗大鼠海馬神經(jīng)元缺氧所致的凋亡、壞死作用［5］。本研究通過(guò)建立體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元缺氧所致鈣超載模型，模擬急性腦缺血缺氧造成的神經(jīng)元鈣超載，進(jìn)一步探討蕨麻正丁醇部位對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元缺氧所致鈣超載的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品及試劑 蕨麻購(gòu)自青海玉樹(shù)，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院孫啟時(shí)教授鑒定為薔薇科委陵菜屬植物鵝絨委陵菜的塊根。以70%乙醇提取濃縮后以水分散，依次以石油醚、氯仿、正丁醇萃取，減壓濃縮，得正丁醇提取部位。尼莫地平注射液購(gòu)自拜耳醫(yī)藥公司，批號(hào)BXC94E3。DMEM-F12培養(yǎng)基(GIBCO，美國(guó));N2營(yíng)養(yǎng)因子(GIBCO，美國(guó));Fura-2，AM Ester染料(Biotium，美國(guó));Calpain 1 引物(Invitrogen，美國(guó));總RNA提取試劑盒(TaKaRa，日本);兔抗大鼠 calpain1多克隆抗體(Santa Cruz，美國(guó))。

1.1.2 主要儀器 熒光分光光度計(jì)RF-5301(島津，日本);FV500激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本);5417R高速低溫離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó));PT-200 PCR熱循環(huán)儀(MJ Research，美國(guó));核酸定量?jī)x(Eppendorf，德國(guó));Bio-Rad 680 酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國(guó));Western Blot電泳儀及電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad，美國(guó))。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠，雌鼠12只雄鼠6只，由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCK-(軍)2002-001。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，室溫26℃，濕度60%，雌雄鼠交配后分離飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)選取24 h內(nèi)新生SD乳鼠進(jìn)行海馬組織分離。

1.2 方法

1.2.1 體外原代大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 取24 h內(nèi)新生SD乳鼠，分離海馬組織，剪碎過(guò)200目濾網(wǎng)篩，用DEME-F12培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%鏈霉素、1%青霉素和5%葡萄糖稀釋細(xì)胞懸液，以4×105個(gè)/mL的密度接種于培養(yǎng)皿，48 h換全液撤去胎牛血清，加1%N2神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，以后每3～4天換半液，細(xì)胞共培養(yǎng) 7 d［6］。

1.2.2 缺氧損傷模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 將培養(yǎng)7 d的細(xì)胞用無(wú)糖D-hank's液(預(yù)先充入95%N2-5%CO2混合氣飽和30 min)替代正常培養(yǎng)基，而后將培養(yǎng)細(xì)胞置于95%N2-5%CO2混合氣37℃培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺氧損傷模型組、尼莫地平(2 μmol/L)干預(yù)組以及蕨麻正丁醇部位高劑量(0.25 mg/mL)、中劑量(0.062 5 mg/mL)、低劑量(0.0156 mg/mL)。

1.2.3 ［Ca2+］i的測(cè)定 ①制備樣品:將細(xì)胞消化，并以1000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，離心半徑5 cm。棄上清，將細(xì)胞懸浮于1 mL Hanks BSA液中，導(dǎo)入Fura-2 AM染料，終濃度為1 μmol/L，37℃震蕩孵育30 min。相同條件離心10 min，棄上清，將細(xì)胞懸浮于Hanks buffer緩沖液中。②上機(jī)檢測(cè):檢測(cè)樣品340 nm、380 nm 2處波長(zhǎng)值;加入10%Tritonx-100終濃度為0.1%(30 min)，檢測(cè) 340 nm、380 nm 2 處波長(zhǎng)值;加入乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA，為鈣離子螯合劑)終濃度為5 mmol/L(30 min)，檢測(cè)340 nm、380 nm 2處波長(zhǎng)值。計(jì)算公式:

［Ca2+］i=kd(FD/FS)×(R-Rmin/Rmax-R)

kd為Fura-2與鈣反應(yīng)的解離常數(shù)，生理?xiàng)l件下kd為224 nmol/L，Rmax為Fura-2全部與鈣結(jié)合時(shí)飽和的熒光比值，Rmin為Fura-2完全未與鈣結(jié)合時(shí)熒光比值，F(xiàn)D和FS分別代表無(wú)鈣和鈣飽和狀態(tài)下380 nm處的熒光強(qiáng)度。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)Calpain1基因表達(dá) 按總RNA抽提試劑盒操作提手冊(cè)取各組細(xì)胞的總RNA，取A260/A280值在1.8～2.0的 RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用PCR熱循環(huán)儀合成cDNA。PCR引物的設(shè)計(jì)與合成，根據(jù) GenBank給出的基因序列，采取 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表1。40 μL反應(yīng)體系包括:上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，5 × RNA PCR Buffer 10 μL，滅菌三蒸水 28.75 μL，TaKaRa Taq 0.25 μL。擴(kuò)增條件:94℃ 5 min，預(yù)變性后，94℃ 30 s、60℃ 45 s、72 ℃ 1 min，共30 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后，取Calpain 1和β-actin PCR產(chǎn)物，電泳40 min(55 V)。以同一樣品Calpain 1擴(kuò)增帶的光密度分別與β-actin擴(kuò)增帶的光密度比值，作為 RT-PCR產(chǎn)物的相對(duì)含量。

表1 PCR引物序列Table 1 Priner sequences for PCR detection of Calpain 1 and β-actin genes

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Calpain 1蛋白 將細(xì)胞爬片丙酮固定4 h，封閉非特異性抗原，加入兔抗大鼠Calpain 1多克隆抗體(1∶1000、4℃)，加入生物素化山羊抗兔二抗工作液(37℃、1h)，滴加SP復(fù)合物(37℃、1 h)，DAB顯色液中顯色。蘇木精復(fù)染胞核，脫水、透明、封固。正常對(duì)照以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，其余步驟相同。顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選擇200倍視野，以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)Calpain 1蛋白 按總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取蛋白，考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定法進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。采用SDS-PAGE恒壓電泳分離蛋白，濃縮膠為80 V，分離膠為120 V。垂直電轉(zhuǎn)移槽將分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，恒流90 V電轉(zhuǎn)移2 h。沖洗PVDF膜后將其置于5%BSA封阻液(1 h)，加入兔抗大鼠Calpain 1多克隆抗體(1∶1000稀釋、4℃)，加入生物素化山羊抗兔二抗工作液(37℃、1 h)，滴加SP復(fù)合物(37℃、1 h)，DAB 顯色液中顯色。以同一樣品Calpain 1條帶的光密度與β-actin的光密度的比值，作為蛋白的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多實(shí)驗(yàn)組結(jié)果采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)細(xì)胞［Ca2+］i檢測(cè) 熒光分光光度計(jì)檢測(cè)各組細(xì)胞［Ca2+］i，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺氧損傷模型組較正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i顯著增加(P＜0.01);尼莫地平組及NP高、中、低劑量干預(yù)組與缺氧損傷模型組相比較神經(jīng)元［Ca2+］i顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 免疫熒光雙重染色觀察神經(jīng)元細(xì)胞骨架 400倍激光共聚焦顯微鏡觀察PI標(biāo)記的細(xì)胞核呈紅色熒光，MAP2標(biāo)記的細(xì)胞骨架蛋白呈綠色熒光，兩者共定位顯示黃色熒光。正常對(duì)照組可見(jiàn)綠色熒光均勻分布于細(xì)胞質(zhì)、軸突和樹(shù)突內(nèi)，熒光表達(dá)量強(qiáng)，神經(jīng)元形態(tài)呈現(xiàn)清晰，細(xì)胞核紅染形態(tài)完好;模型組綠色熒光散在分布于細(xì)胞質(zhì)、軸突及樹(shù)突中，神經(jīng)元突起形態(tài)不能良好呈現(xiàn)，與正常組相比軸突、樹(shù)突內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯減弱;尼莫地平組及高劑量NP干預(yù)組神經(jīng)元突起形態(tài)良好呈現(xiàn)，與模型組相比綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng);中劑量NP干預(yù)組大部分神經(jīng)元軸突及樹(shù)突中可見(jiàn)綠色熒光，呈現(xiàn)部分神經(jīng)元突起結(jié)構(gòu)，與模型組相比綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng);低劑量 NP干預(yù)組僅在少量神經(jīng)元突起中可見(jiàn)綠色熒光，但與模型組相比其綠色熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng)。見(jiàn)圖2。

圖1 各組神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度比較Figure 1 Intracellular concentrations of［Ca2+］iin different groups

圖2 各組細(xì)胞中MAP2、PI免疫熒光雙重染色(×400)Figure 2 Stained with MAP2 and PI in different groups by LSCM(×400)

2.3 RT-PCR檢測(cè)Calpain 1基因表達(dá) PCR結(jié)果顯示引物特異性良好，基因擴(kuò)增單一。缺氧損傷模型組較正常對(duì)照組神經(jīng)元Calpain 1 mRNA的表達(dá)量升高(P＜0.05);尼莫地平組及NP高、中、低劑量干預(yù)組與模型組相比較神經(jīng)元Calpain 1 mRNA的表達(dá)量均降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Calpain 1蛋白表達(dá)200倍視野可見(jiàn)Calpain 1蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物均呈棕黃色顆粒。正常對(duì)照組細(xì)胞免疫組化染色玻片中，Calpain 1蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)較弱，而缺氧模型組細(xì)胞Calpain 1蛋白表達(dá)增強(qiáng)。與正常對(duì)照組比較，模型組Calpain 1免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞率升高(P＜0.05);尼莫地平組及NP高、中、低劑量干預(yù)組與模型組比較，免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞率積均有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)圖4、圖5。

2.5 Western blot法檢測(cè)Calpain 1蛋白表達(dá) 缺氧模型組神經(jīng)元Calpain 1蛋白的表達(dá)量較正常對(duì)照組升高(P＜0.05);尼莫地平組及NP高、中、低劑量干預(yù)組與模型組相比較神經(jīng)元Calpain 1蛋白的表達(dá)量均降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖6。

圖3 NP對(duì)缺氧神經(jīng)細(xì)胞Calpain 1基因表達(dá)的抑制作用(×400)Figure 3 Inhibitory effects of NP on Calpain 1 mRNA of hypoxia neurons(×400)

圖4 各組細(xì)胞中免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Calpain 1蛋白表達(dá)(×400)Figure 4 Expression of Calpain 1 protein from each groups detected by immunocytochemisty(×400)

圖5 各組神經(jīng)細(xì)胞中Calpain 1蛋白陽(yáng)性率比較Figure 5 Comparison of positive rates of Calpain 1 protein in neurocytes from each group

圖6 NP對(duì)缺氧神經(jīng)細(xì)胞Calpain 1蛋白表達(dá)的抑制作用Figure 6 Inhibitory effects of NP on Calpain 1 protein ofhypoxia neurons

3 討 論

鈣超載是指各種原因引起的鈣平衡系統(tǒng)功能失調(diào)，鈣分布紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞［Ca2+］i異常升高［7］。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生鈣超載時(shí)，可引起線粒體內(nèi)氧化磷酸化過(guò)程障礙、線粒體膜電位降低、三磷酸腺苷生成障礙［8］，以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)磷脂酶、蛋白酶等激活［9］，導(dǎo)致并促進(jìn)細(xì)胞的不可逆性損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞膜上電壓依賴(lài)性鈣離子通道持續(xù)開(kāi)放，將誘發(fā)細(xì)胞［Ca2+］i的急劇增加導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡［10］。Sibarov等［11］研究顯示，神經(jīng)細(xì)胞膜上鈉鈣泵持續(xù)開(kāi)放，將使細(xì)胞內(nèi)大量鈣離子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，使細(xì)胞［Ca2+］i明顯減少，抑制鈣超載和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)神經(jīng)元缺氧3 h時(shí)，細(xì)胞［Ca2+］i顯著高于正常細(xì)胞［Ca2+］i，而各劑量 NP均顯著降低了缺氧神經(jīng)元［Ca2+］i，且［Ca2+］i隨 NP劑量的增加神經(jīng)元而減少，說(shuō)明缺氧誘發(fā)了［Ca2+］i的升高。NP可抑制缺氧所致神經(jīng)元［Ca2+］i的增加，且具有劑量依賴(lài)性。

Calpain 1是鈣依賴(lài)性的蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白水解酶家族成員［12］。鈣超載時(shí)，Ca2+與其結(jié)合構(gòu)象發(fā)生變化，Calpain 1被激活［13］，其通過(guò)特異性蛋白水解酶作用水解細(xì)胞骨架，微絲分解、微管解聚，嚴(yán)重影響軸漿正常運(yùn)輸，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡［14］。微管相關(guān)蛋白 2(microtuble-associated protein2，MAP2)結(jié)合于微管的表面，使微管蛋白亞基聚合，并中和微管表面相互排斥的負(fù)電荷［15］，增加微管的穩(wěn)定性及聚合能力，為Calpain 1特異性底物，且只存在于神經(jīng)元［16］。MAP2被作為特異性神經(jīng)元損傷程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。結(jié)果顯示，缺氧3 h時(shí)細(xì)胞內(nèi)Calpain 1 mRNA及其蛋白水平顯著高于正常組細(xì)胞內(nèi)的含量，且激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)MAP2標(biāo)記的蛋白熒光強(qiáng)度減弱，神經(jīng)元突起形態(tài)不能良好呈現(xiàn);給予NP高、中劑量干預(yù)組Calpain 1 mRNA及其蛋白均顯著降低缺氧細(xì)胞內(nèi)的含量，且與缺氧組相比熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，大部分神經(jīng)元突起可良好呈現(xiàn)。說(shuō)明缺氧3 h時(shí)激活了鈣離子依賴(lài)的下游蛋白激酶Calpain 1基因和蛋白水平的表達(dá)，并且破壞了細(xì)胞骨架。而NP高、中劑量組顯著抑制了鈣離子依賴(lài)的下游蛋白激酶Calpain 1基因和蛋白水平的表達(dá)，有效保護(hù)了細(xì)胞骨架。因此，蕨麻正丁醇部位可通過(guò)抑制缺氧所致細(xì)胞鈣超載而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用［17］。

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