劉云霄，向 鵬，羅紅麗

(海南大學(xué)海南省熱帶作物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70228)

組蛋白是染色體的結(jié)構(gòu)蛋白，它能夠與DNA結(jié)合而形成核小體，是核小體的基本組成單位［1］.組蛋白可以發(fā)生多種修飾，包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化以及ADP核糖基化等［2］，這些共價(jià)修飾能夠通過(guò)改變DNA雙鏈與組蛋白的親和性來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)型，或者通過(guò)影響反式作用因子與啟動(dòng)子的親和性來(lái)調(diào)控特定基因的表達(dá).這些共價(jià)修飾之間存在協(xié)同和級(jí)聯(lián)效應(yīng)，能夠通過(guò)多種修飾方式的組合發(fā)揮其調(diào)控功能，從而維持生物體的正常生長(zhǎng)發(fā)育，并對(duì)不同生物和非生物的脅迫作出響應(yīng)［3-5］.

組蛋白泛素化修飾包括多泛素化和單泛素化2種類型，其中單泛素化修飾多發(fā)生于組蛋白H2A和H2B上［6-10］.目前，在植物中只發(fā)現(xiàn)2個(gè)組蛋白H2B單泛素連接酶基因，即在擬南芥中與BRE1基因同源的AtHUB1和AtHUB2基因，它們的編碼產(chǎn)物都包含一個(gè)保守的RING指結(jié)構(gòu)域，屬于RING型E3連接酶.這類蛋白廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，在細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、花期、光形態(tài)建設(shè)及種子休眠等方面發(fā)揮功能.研究發(fā)現(xiàn)，HUB1-1基因缺失突變體與野生型相比，其株型明顯變小、核內(nèi)DNA量減少而復(fù)制增加、在DNA復(fù)制后期(G2)向分裂期(M)轉(zhuǎn)化的特異基因表達(dá)量降低，表明AtHUB1的缺失阻滯了HUB1-1突變體中細(xì)胞分裂由G2-to-M的轉(zhuǎn)化［11］.擬南芥FLC基因(Flowering Locus C)是重要的花期調(diào)控基因.研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LC基因所在的染色質(zhì)組蛋白H2B能夠被AtHUB1進(jìn)行單泛素化修飾，這種修飾可以促進(jìn)H3組蛋白在K4和K36位點(diǎn)發(fā)生甲基化，進(jìn)而激活FLC及相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致植物表現(xiàn)晚花表型［12-14］.另有研究報(bào)道，擬南芥HUB1介導(dǎo)的H2B組蛋白單泛素化與種子休眠有關(guān)，當(dāng)T-DNA插入突變體ΔHUB1中時(shí)休眠相關(guān)基因的表達(dá)受到了抑制，種子表現(xiàn)出休眠缺陷表型，而且該作用與ABA介導(dǎo)的信號(hào)途徑有關(guān)［15-16］;同時(shí)，擬南芥H2B組蛋白單泛素化修飾還參與了光形態(tài)建設(shè)和生物鐘的調(diào)節(jié)［17-18］.此外，擬南芥AtHUB1是腐生病原真菌防衛(wèi)反應(yīng)的調(diào)節(jié)組分，其功能缺失突變體ΔHUB1對(duì)腐生病原真菌Alternaria brassicicola和Botrytis cinerea表現(xiàn)出高度的感病［19］.

本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆了水稻中的一個(gè)RING型組蛋白H2B單泛素化連接酶基因OsHUB1，初步分析了該基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式.研究表明:該基因的表達(dá)受到了植物激素SA和JA的誘導(dǎo)，它可能參與了植物中由SA和JA介導(dǎo)的信號(hào)途徑，這為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 日本晴(Orazy sativa‘Nipponbare’)，

1.1.2 質(zhì)粒和菌株 pGEM-T easy購(gòu)自Promega公司，大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自北京艾德生物科技有限公司.

1.1.3 試劑盒、工具酶及生化試劑 植物總RNA Trizol試劑盒、DNaseⅠ購(gòu)自Invitrogen;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Pyrobest高保真酶購(gòu)自TaKaRa公司;DNA回收試劑盒、Taq DNA Polymerase以及各種限制性內(nèi)切酶和PCR相關(guān)試劑均來(lái)自NEB公司;引物合成由Invitrogen公司合成，測(cè)序由上海生工完成.

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 按照Invitrogen公司Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取.

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增OsHUB1基因 根據(jù)擬南芥HUB1(At2g44950)的堿基序列，通過(guò)Rice Genome Annotation Project BLAST Search進(jìn)行Blastx在線比對(duì)，獲得水稻中同源基因的堿基序列(基因序列號(hào):LOC_0s4g46450).根據(jù)該序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增OsHUB1基因開(kāi)放閱讀框的特異性正向引物(OsHUB1-F:5＇-ATAGGATCCATGGGGAGCACGGGGGAGCCC-3＇)和 反 向 引 物 (OsHUB1-R:5＇-GCGGGTACCTATGTAGATAGGTTTCACGTC-3＇)，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成.以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增.具體反應(yīng)體系為:10×Pyrobest buffer(Mg2+plus)5 μL，基因特異性正向引物OsHUB1-F和反向引物Os-HUB1-R 各 1 μL，dNTP mix(2.5 mmol·L-1)4 μL，cDNA 1 μL，高保真酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL，ddH2O 37.5 μL.PCR反應(yīng)條件如下:95℃ 4 min;95℃ 35 s，55℃ 45 s，72℃ 4 min，共32個(gè)循環(huán);72℃ 5 min.反應(yīng)結(jié)束后，以w=1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，隨后，待條帶回收后送往公司測(cè)序.

1.2.3 生物信息學(xué)分析 用DNASTAR軟件分析OsHUB1基因cDNA全長(zhǎng)核苷酸序列和推測(cè)氨基酸序列;隨后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中將OsHUB1的氨基酸序列與Genebank中已經(jīng)發(fā)布的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì).不同物種的HUB蛋白氨基酸序列的同源性比對(duì)是利用Lasergene軟件完成的.

1.2.4 樣品處理 分別用濃度為0.1 mol·L-1的SA和JA噴灑于三葉期水稻幼苗的葉片表面，直到葉面均勻布滿霧滴為止，同樣，于對(duì)照植株上噴施無(wú)菌水.將激素處理后的水稻幼苗置于光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，溫度為(25±1)℃，光照周期為12 h，濕度為75%.

1.2.5 表達(dá)分析 在噴施SA、JA后，于不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、60 h)取水稻葉片，并按Trizol試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取總RNA，同時(shí)按DNaseⅠ說(shuō)明書(shū)消化其中殘余的基因組DNA，然后取等量處理過(guò)的RNA并以其為模板進(jìn)行cDNA的合成.PCR反應(yīng)按以下條件進(jìn)行:95℃ 4 min;95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共26個(gè)循環(huán);72℃ 5 min.反應(yīng)結(jié)束后于w=1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻OsHUB1基因編碼區(qū)的擴(kuò)增 采用RT-PCR擴(kuò)增水稻OsHUB1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA，電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1.在2 500～3 000 bp之間獲得一條特異性的亮帶，將該條帶回收測(cè)序，結(jié)果顯示該片段包含2 655個(gè)堿基對(duì)，是一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，其編碼產(chǎn)物為885個(gè)氨基酸的多肽，理論分子量為100.3 kD，理論等電點(diǎn)為7.785，屬于堿性蛋白(見(jiàn)圖2).

圖1 OsHUB1基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增

圖2 OsHUB1核苷酸序列及其推測(cè)的氨基酸序列

2.2 OsHUB1的生物信息學(xué)分析 根據(jù)水稻數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息，通過(guò)網(wǎng)站http://www.softberry.com對(duì)OsHUB1基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線分析，結(jié)果顯示，OsHUB1基因全長(zhǎng)7 803 bp，由18個(gè)內(nèi)含子和17個(gè)外顯子組成(如圖3所示).通過(guò)http://smart.embl-heidelberg.de/help/smart_glossary.shtml網(wǎng)站對(duì)OsHUB1蛋白可能的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該蛋白C端有一高度保守的RING指結(jié)構(gòu)域，N端存在一個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域(Low compositional complexity regions，LCRs)和一個(gè)Coiled-Coil區(qū)(如圖4所示).

圖3 OsHUB1基因結(jié)構(gòu)示意圖

圖4 OsHUB1蛋白結(jié)構(gòu)域分析

將OsHUB1蛋白氨基酸序列在Genebank中與已經(jīng)發(fā)布的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)OsHUB1蛋白與短柄草(Brachypodium distachyon)、楊樹(shù)(Populus tomentosa)、葡萄(Vitis vinifera)、大豆(Glycine max)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)的E3泛素連接酶分別具有78%，68%，68%，67%和62%的同源性.這些HUB1同源蛋白的C端均含有一個(gè)保守的RING指結(jié)構(gòu)域，其中Cys-Xxx2-Cys-Xxx9-39-Cys-Xxx1-3-His-Xxx2-3-Cys/His-Xxx2-Cys-Xxx4-48-Cys-Xxx2-Cys分子結(jié)構(gòu)模式高度保守，為該類E3泛素連接酶表現(xiàn)連接活性所必不可少的，其中Xxx代表任一氨基酸(如圖5所示).以上分析結(jié)果說(shuō)明，所擴(kuò)增的OsHUB1基因是水稻中的RING型E3泛素連接酶的同源基因.

圖5 不同植物來(lái)源的HUB1蛋白與OsHUB1蛋白R(shí)ING-finger結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的同源性比較

2.3 不同信號(hào)分子處理水稻后OsHUB1的表達(dá)變化 SA和JA是植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的信號(hào)分子［9-10］，它們所介導(dǎo)的植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用.為了探究水稻Os-HUB1基因與不同信號(hào)途徑的關(guān)系，筆者分析了SA和JA處理水稻幼苗不同時(shí)間后OsHUB1基因的表達(dá)變化情況，結(jié)果如圖6和圖7所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在內(nèi)參基因OsActin表達(dá)相同的條件下，SA處理水稻幼苗6 h時(shí)，OsHUB1基因的表達(dá)被明顯誘導(dǎo)，24 h后有所下降(見(jiàn)圖6);同樣，用JA處理水稻幼苗6 h也能夠明顯誘導(dǎo)OsHUB1基因的表達(dá)(見(jiàn)圖7).以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，OsHUB1基因?qū)A和JA都能夠產(chǎn)生應(yīng)答，它可能參與了水稻中的SA和JA介導(dǎo)的抗病信號(hào)途徑.

圖6 SA處理水稻幼苗對(duì)OsHUB1表達(dá)的影響

圖7 JA處理水稻幼苗對(duì)OsHUB1表達(dá)的影響

3 討論

本研究克隆了水稻HUB1的同源基因OsHUB1，其開(kāi)放閱讀框?yàn)? 655 bp，它編碼一個(gè)具有885個(gè)氨基酸殘基的多肽.氨基酸序列分析表明，該蛋白C端有一個(gè)典型的RING指結(jié)構(gòu)域，屬于RING型泛素E3連接酶.在擬南芥中的研究表明，HUB1參與了植物對(duì)腐生病原真菌的防衛(wèi)反應(yīng)，并主要通過(guò)SA和JA信號(hào)途徑發(fā)揮作用［19］.本研究結(jié)果亦表明，水稻中SA和JA也可以誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，這與擬南芥中的研究結(jié)果基本一致.但也可以看到，SA對(duì)OsHUB1基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用在6 h和12 h時(shí)最強(qiáng)，之后明顯下降，這暗示:盡管OsHUB1基因同時(shí)參與SA和JA介導(dǎo)的信號(hào)途徑，但其依賴的上游信號(hào)組分并不相同.

從圖5的比對(duì)結(jié)果來(lái)看，盡管不同物種來(lái)源的HUB1蛋白的同源性不高，如水稻OsHUBI與擬南芥AtHUB1的同源性僅為62%，但其中的RING結(jié)構(gòu)域卻十分保守.在生化功能方面，AtHUB1具有體外和體內(nèi)的E3連接酶活性，可以特異性地催化組蛋白H2B的單泛素化修飾，其中的RING指結(jié)構(gòu)域?yàn)閱畏核鼗磻?yīng)所必須.因此推測(cè)，水稻OsHUB1應(yīng)該同樣具有E3連接酶活性，能夠?qū)Φ孜镞M(jìn)行泛素化修飾.根據(jù)圖4顯示的結(jié)果，OsHUB1蛋白中除了RING指結(jié)構(gòu)域外，還具有一個(gè)coiled-coil regions結(jié)構(gòu)和一個(gè)N端的LCRs結(jié)構(gòu).LCRs是普遍存在于真核生物蛋白中的一種結(jié)構(gòu)，與蛋白分子的分化有關(guān)，而且它在蛋白分子中的位置與其功能關(guān)系緊密.一般認(rèn)為，位于蛋白端部的LCRs與蛋白的脅迫應(yīng)答有關(guān)［20］，因此推測(cè):OsHUB1可能在水稻的抗病性中發(fā)揮重要作用.coiled-coil regions結(jié)構(gòu)往往與蛋白分子內(nèi)高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和蛋白分子間的相互作用有關(guān)［21］，這暗示水稻中可能存在OsHUB1的互作蛋白.根據(jù) DHAWAN等人的研究，擬南芥HUB1基因的T-DNA插入突變體莖稈的表皮細(xì)胞壁與野生型相比明顯變薄，過(guò)量表達(dá)HUB1基因的植株表皮細(xì)胞壁則比野生型的明顯變厚，表明HUB1很可能通過(guò)改變細(xì)胞壁厚度來(lái)抵抗病原菌的侵染，這與植物通過(guò)細(xì)胞壁的物理屏障抵抗腐生病原真菌的抗病機(jī)制相符合.此外，研究發(fā)現(xiàn)，AtHUB1能夠與轉(zhuǎn)錄介體復(fù)合物的一個(gè)亞基MED21發(fā)生相互作用，該亞基不僅能夠增強(qiáng)植物抗病性，還對(duì)種子的胚胎發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用.同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，AtHUB1和AtMED21都可以被幾丁質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)［19］，這暗示AtHUB1是協(xié)同AtMED21，并通過(guò)激活植物病原相關(guān)分子模式激發(fā)的免疫反應(yīng)(Pathogen Associated Molecular Pattern triggered immunity，PTI)來(lái)調(diào)控植物對(duì)腐生病原真菌的抗病性.在對(duì)果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)，不同的基因轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程都需要轉(zhuǎn)錄介體復(fù)合物的參與，其中包括抗微生物多肽的表達(dá)［22］，因此普遍認(rèn)為，當(dāng)上游調(diào)節(jié)因子和染色質(zhì)發(fā)生修飾時(shí)，MED21能夠感受這些信號(hào)并將其傳遞給RNA聚合酶II來(lái)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá).但是根據(jù)我們尚未發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，水稻OsHUB1與OsMED21之間并不存在明顯的相互作用(未發(fā)表數(shù)據(jù))，這暗示水稻OsHUB1與擬南芥中同源基因的生物功能可能存在差異.因此，為了闡明水稻OsHUB1基因的生物學(xué)功能，需要通過(guò)構(gòu)建該基因在水稻中的敲除(或敲減)突變體和過(guò)量表達(dá)突變體來(lái)做進(jìn)一步的分析.

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