馮 龍，郭文濤，路武豪，孫薩迦，董子明#

1)河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)科 鄭州 450008 2)漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 漯河 462002 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 鄭州 450001

DNA 聚合酶 β(DNA polymerase β，DNA polβ)是堿基切除修復(fù)過程中的關(guān)鍵酶[1-3]。polβ最主要的功能是在堿基切除修復(fù)中填補(bǔ)由堿基切除所產(chǎn)生的非常短的核苷酸缺口[4]。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，DNA polβ 在多種腫瘤組織和細(xì)胞內(nèi)存在高水平表達(dá)，并且與一些腫瘤的發(fā)生有關(guān)。因此，進(jìn)一步研究DNA polβ在DNA修復(fù)中的作用機(jī)制，以及該酶在人類腫瘤組織中的表達(dá)特征，已經(jīng)成為腫瘤分子機(jī)制研究中的一個熱點(diǎn)[7]?；蚯贸茄芯拷M織或器官中基因功能的重要手段，已經(jīng)成功地應(yīng)用在各種類型的細(xì)胞中[8]，并且，人類體細(xì)胞基因敲除也獲得成功。為了深入研究DNA polβ突變和異常表達(dá)在食管癌發(fā)病中的作用，作者建立人食管癌Eca9706細(xì)胞DNA polβ基因敲除模型，為深入研究DNA polβ的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 Eca9706細(xì)胞是高分化食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，2002年從一中國來源的高分化食管鱗狀細(xì)胞癌的男性患者腫瘤組織中分離并建系。

1.2 基因敲除載體構(gòu)建 以Eca9706細(xì)胞基因組為模板，設(shè)計(jì)上游和下游同源序列引物，PCR擴(kuò)增得到上游(1280 bp)和下游(1756 bp)同源序列，分別將其克隆入骨架載體pcDNA3.1(包含neo基因，用于G418篩選)中，經(jīng)酶切和PCR擴(kuò)增鑒定獲得陽性克隆重組子pOUT-polβ，最后用限制性內(nèi)切酶EcoR V使其線性化。

1.3 細(xì)胞導(dǎo)入方法 采用電穿孔法將線性化的打靶載體pOUT-polβ導(dǎo)入Eca9706細(xì)胞中。將擴(kuò)增后的Eca9706細(xì)胞用胰蛋白酶消化后重懸于PBS中，使細(xì)胞密度達(dá)到2×107mL－1以上。將50 μg線性化的打靶載體DNA與1 mL細(xì)胞混勻，裝入電穿孔槽中電擊，電擊參數(shù):600 V，25 Μf，200 Ω，電擊時間為7 s;然后將電擊后的細(xì)胞分裝入長滿Eca9706細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，24 h后換成Eca9706細(xì)胞篩選培養(yǎng)液(含G-418800 mg/L的DMEM培養(yǎng)基)，并設(shè)對照組(正常的Eca9706細(xì)胞)，2～3 d換液1次，觀察培養(yǎng)細(xì)胞，挑選單克隆，同樣條件篩選培養(yǎng)。將鑒定后獲得的基因敲除細(xì)胞株用G-418維持質(zhì)量濃度(200 mg/L)擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4 PCR檢測基因敲除細(xì)胞中DNA polβ基因敲除區(qū)段DNA存在情況 參照QIAGEN公司基因組提取試劑盒說明，提取細(xì)胞基因組DNA，設(shè)計(jì)并合成DNA polβ引物(上游引物:5'-AAAGGATTCCAGATAAA CAC-3';下游引物:5'-GCTGGAAGGAAAGAAGAAAG-3')，擴(kuò)增片段長度499 bp。PCR擴(kuò)增鑒定敲除細(xì)胞中DNA polβ基因敲除區(qū)段DNA存在情況，并同時擴(kuò)增對照組Eca9706細(xì)胞中DNA polβ基因。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸45 s，34個反應(yīng)循環(huán);72℃再延伸2 min。PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 RT-PCR檢測細(xì)胞中DNA polβ mRNA表達(dá)情況 Trizol法提取細(xì)胞總RNA，AMV酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用 polβ 引物(上游:5'-GAGAAGAACGTGAGC CAAGC-3';下游:5'-CATCCATGTCACCACTGGAC-3')和內(nèi)參 β-actin引物(上游:5'-ACACTGTGCCCATC TACGAGG-3';下游:5'-CTTTGCGGATGTCCACGTC-3')分別擴(kuò)增基因敲除細(xì)胞和Eca9706細(xì)胞。DNA polβ擴(kuò)增片段長度為499 bp。PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 Western blot檢測細(xì)胞中DNA polβ蛋白表達(dá)情況 收集基因敲除后的Eca9706細(xì)胞及對照組Eca9706細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色法測蛋白濃度。取20 μL待測樣品置于12 g/L聚丙烯酰胺凝膠上，電泳3 h后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。剪下有目的條帶的膜放入復(fù)性劑中，5 min后放入1∶100稀釋的特異性鼠抗人DNA polβ單克隆抗體中，4℃過夜;加入1∶100稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫振蕩2 h后用封閉液洗滌，DAB顯色。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 用血清饑餓法對細(xì)胞進(jìn)行同步化處理，使細(xì)胞周期停滯在G0期?；蚯贸?xì)胞和對照組Eca9706細(xì)胞經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化處理后，制成單細(xì)胞懸液。每組取1×106個細(xì)胞，PBS洗2次，加入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，－20℃固定30 min，檢測前離心去除乙醇，生理鹽水洗滌2次，加入含10 mg/L碘化丙啶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%RNA酶的PBS，室溫避光孵育20 min，上流式細(xì)胞儀于488 nm波長處進(jìn)行檢測，分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 基因敲除細(xì)胞和對照組Eca9706細(xì)胞生長曲線的繪制 分別取對數(shù)生長期的基因敲除細(xì)胞和對照組Eca9706細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個細(xì)胞，每組5個復(fù)孔，分別于接種后的第1～7天加MTT(5 g/L)，20 μL/孔，37 ℃、體積分?jǐn)?shù) 5%CO2溫箱中繼續(xù)孵育4 h，棄上清后加DMSO 150 μL/孔，37℃振蕩20 min，使結(jié)晶充分溶解，于490 nm波長處在酶聯(lián)儀上測定各孔吸光度值，以時間為橫軸、吸光度值為縱軸，繪制2組細(xì)胞生長曲線。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，2組間細(xì)胞周期分布的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 基因敲除細(xì)胞中DNA polβ基因敲除區(qū)段DNA存在情況及DNA polβ mRNA和蛋白的表達(dá)情況提取細(xì)胞基因組DNA，PCR鑒定DNA polβ基因敲除區(qū)段DNA存在情況。對照組Eca9706細(xì)胞可見一明顯條帶位于500 bp處，而 DNA polβ基因敲除的Eca9706細(xì)胞未見條帶，說明靶基因已被敲除(圖1)。提取細(xì)胞基因組RNA，RT-PCR檢測polβ mRNA表達(dá)水平，Eca9706細(xì)胞組可見一明顯條帶位于500 bp處，基因敲除Eca9706細(xì)胞組未見條帶，說明含有基因敲除載體并攜帶neo抗性基因的Eca9706細(xì)胞中DNA polβ mRNA表達(dá)缺失(圖2)。Western blot結(jié)果顯示:在相對分子質(zhì)量39000處可見正常Eca9706細(xì)胞DNA polβ蛋白表達(dá)，而基因敲除Eca9706細(xì)胞未表達(dá)(圖3)。

圖1 DNA polβ基因敲除區(qū)段DNA存在情況的PCR鑒定結(jié)果

圖2 基因敲除Eca9706細(xì)胞中DNA polβ mRNA表達(dá)情況鑒定結(jié)果

圖3 基因敲除Eca9706細(xì)胞中DNA polβ蛋白表達(dá)情況鑒定結(jié)果

2.2 敲除DNA polβ基因的Eca9706細(xì)胞的生長曲線和細(xì)胞周期

2.2.1 細(xì)胞生長曲線 見圖4。由生長曲線可以看出，基因敲除細(xì)胞生長曲線較平緩，細(xì)胞生長速度較正常細(xì)胞降低。

圖4 敲除DNA polβ基因的Eca9706細(xì)胞與Eca9706細(xì)胞的生長曲線

2.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 2組細(xì)胞周期分布見表1?？芍?，2組G2～M期、S期細(xì)胞百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而G0～G1期細(xì)胞百分比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 2組細(xì)胞周期分布 %

3 討論

3.1 DNA polβ基因敲除載體的構(gòu)建 基因敲除技術(shù)是根據(jù)同源重組的原理，使外源目的基因與受體細(xì)胞染色體DNA上的同源序列發(fā)生重組，并將目的基因整合在預(yù)定位點(diǎn)，以改變細(xì)胞遺傳特性為目的的分子生物學(xué)技術(shù)[9]。實(shí)驗(yàn)過程受到重組效率低、目的片段隨機(jī)插入等諸多因素的影響，因此，打靶載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建是基因敲除技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在很大程度上決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。該研究所構(gòu)建的打靶載體，用目的基因替換DNA polβ基因的部分同源序列，目的是破壞DNA polβ基因的生物功能。該打靶載體全長約7800 bp，上游同源序列長約1280 bp，下游同源序列長約1756 bp。一旦發(fā)生同源重組，它將替換掉DNA polβ基因啟動子的核心區(qū)，而且還將替換掉DNA polβ 基因第1、2、3外顯子和第1、2 內(nèi)含子的全部以及第3內(nèi)含子的大部分，導(dǎo)致DNA polβ基因功能的喪失。

3.2 基因敲除對細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖的影響 敲除DNA polβ基因后，靶細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖也隨之發(fā)生變化。表現(xiàn)為與對照組Eca9706細(xì)胞相比，基因敲除細(xì)胞的S期細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞生長曲線變平緩?；谝陨涎芯拷Y(jié)果可知，無DNA polβ基因的Eca9706細(xì)胞，其細(xì)胞增殖及細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性受到一定的影響。由于該實(shí)驗(yàn)是在體細(xì)胞水平進(jìn)行 DNA polβ基因敲除，因此，敲除后的Eca9706細(xì)胞仍然能夠正常生長。相反，若DNA polβ基因過表達(dá)則可導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)惡性轉(zhuǎn)化，生長速度加快。因此，敲除DNA polβ基因可以減緩腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步深入研究后有望運(yùn)用于人類腫瘤的生物治療。

綜上，作者建立人食管癌Eca9706細(xì)胞DNA polβ基因敲除模型，從根本上消除實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞DNA polβ本底對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的干擾，為深入研究DNA polβ突變和異常表達(dá)在食管癌發(fā)病中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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