鄔向東，陶明華，陳如圣，陶明江，張祥華，陳瑞光

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動科院，江西 南昌 330045；2.上海海利生物技術(shù)股份有限公司）

豬猝死征主要是由魏氏梭菌混合其它細(xì)菌共同引起的一種急性死亡癥。魏氏梭菌廣泛存在人畜糞便、土壤、水等環(huán)境中，該菌群屬典型的條件性致病菌，它可引發(fā)地區(qū)性流行病，每年都有大量的動物因不同類型魏氏梭菌感染而死亡。尤其是近年來我國發(fā)生家畜猝死征與該菌有關(guān)，發(fā)病急、病程短、無任何前期癥狀而突然死亡，而且死亡率極高。一般發(fā)生于育肥豬、母豬，呈散發(fā)性流行。

2013年12月，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院接診一例育肥急性死亡病例，表現(xiàn)為100kg左右的育肥豬突然死亡，死后口鼻流出帶血的泡沫狀液體。當(dāng)?shù)孬F醫(yī)診斷為傳染性胸膜肺炎，但治療效果不理想，轉(zhuǎn)到獸醫(yī)院檢測，診斷為“猝死征”，病原分離得到兩株細(xì)菌，分別為大腸桿菌(JXV-E1203)和魏氏梭菌(JXV-C1203)，根據(jù)檢測結(jié)果針對性用藥，疫情得到控制，現(xiàn)將病原分離與分析情況介紹如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料。某豬場送來的3頭急性死亡肥豬，剖檢后采集肝臟、脾臟、心血、腸內(nèi)容物為細(xì)菌分離病料。

1.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基。革蘭氏染色液、鮮血培養(yǎng)基、牛奶培養(yǎng)基、麥?zhǔn)媳葷峁艿葏⒄瘴墨I(xiàn)自行配制；藥敏紙片。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)。在超凈工作臺中，以無菌操作，用接種環(huán)從病料中鉤菌，劃線接種于鮮血培養(yǎng)基進(jìn)行需氧培養(yǎng)；另采腸道和肝微生物接種于石蕊牛乳培養(yǎng)基，80℃處理30min后，進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。

1.2.1.1 需氧培養(yǎng)。將接種細(xì)菌的鮮血培養(yǎng)基，置37℃普通大氣環(huán)境中，于恒溫箱中恒溫培養(yǎng)24～48h，觀察有無可疑菌落生長，并記錄結(jié)果。

1.2.1.2 厭氧培養(yǎng)。將接種細(xì)菌的石蕊牛乳培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)18～24h，觀察有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，如有，從試管中鉤菌接種鮮血培養(yǎng)基，置厭氧缸中37℃厭氧培養(yǎng)24～48h，觀察有無可疑菌落生長。

1.2.2 細(xì)菌生化鑒定。參照文獻(xiàn)進(jìn)行操作，將分離純化的菌株JXV-E1203，分別接種糖發(fā)酵微量發(fā)酵管、蛋白胨水、糖葡萄蛋白水、檸檬酸鹽利用發(fā)酵管，37℃培養(yǎng)24～48h觀察糖發(fā)酵管顏色變化，同時(shí)進(jìn)行V-P試驗(yàn)、M-R試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)檢測，觀察結(jié)果。

表1 JXV-E1203攻毒小鼠分組及試驗(yàn)結(jié)果 只，mL，%

1.2.3 細(xì)菌小鼠攻毒（見表1）。將需氧分離純化革蘭氏陰性菌株（JXV-E1203）接種鮮血培養(yǎng)基37℃恒溫靜置培養(yǎng)18h，加無菌生理鹽水，將菌苔刮至生理鹽水中獲得菌懸液，再將菌液與麥?zhǔn)媳葷峁鼙容^，估算菌數(shù)后稀釋為3×108CFU/mL，作為小鼠攻毒試用菌液。

隨機(jī)選擇6只相同小鼠，隨機(jī)分為3組，每組兩只，將攻毒菌液分別稀釋成3×108CFU/mL和3×107CFU/mL兩個濃度進(jìn)行分別攻毒，每只皮下注射0.1mL。對照組小鼠每只皮下注射生理鹽水0.1mL。攻毒后3組給予同樣的飼養(yǎng)環(huán)境，每天觀察記錄發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察一周。死亡小鼠及時(shí)剖檢，用肝臟重新分離細(xì)菌。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

分離菌株JXV-E1203在普通大氣環(huán)境下37℃培養(yǎng)24h，生長良好，形成中等大小、光滑、濕潤、邊緣整齊、水滴樣菌落，呈明顯β溶血（圖1）。

圖2 JXV-C1203厭氧培養(yǎng)呈雙溶血環(huán)

分離菌株JXV-C1203在石蕊牛乳培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)18h呈“暴烈發(fā)酵”，在厭氧缸無氧環(huán)境下37℃培養(yǎng)24h后，可見細(xì)菌生長良好，形成直徑2～5mm、表面光滑、半透明的菌落，菌落周圍有雙溶血環(huán)（見圖2）。

2.2 細(xì)菌染色鏡檢結(jié)果

將需氧分離到的菌株JXV-E1203進(jìn)行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌呈球桿狀菌，兩端鈍圓，中等大小，單個存在，有時(shí)成雙排列，革蘭氏染色陰性（見圖3）。

圖3 需氧分離菌株革蘭氏染色結(jié)果

將無氧分離到的菌株JXV-C1203進(jìn)行革蘭氏染色，菌體呈粗大直桿狀，兩端鈍圓，單在或成雙排列，革蘭染色陽性（見圖4）。

圖4 厭氧分離菌株革蘭氏染色結(jié)果

2.3 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

普通大氣分離菌株JXV-E1203，接種微量生化發(fā)酵管，結(jié)果該菌能分解葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、木糖，不分解鼠李糖、楊苷；V-P試驗(yàn)陰性、M-R試驗(yàn)陽性、吲哚試驗(yàn)陽性，初步鑒定為大腸桿菌。

2.4 細(xì)菌小鼠攻毒結(jié)果

小鼠攻毒結(jié)果見表1。高低劑量兩組試驗(yàn)組小鼠分別在第3、4d全部死亡，死亡小鼠均表現(xiàn)肛門出血（見圖5）。

圖5 死亡小鼠肛門出血

剖解可見小鼠表面嚴(yán)重的敗血變化，肝臟、腎臟壞死出血，脾臟出血，整個腸道充滿帶血的粘液，腸道出血嚴(yán)重（見圖6）。

圖6 剖小鼠內(nèi)臟出血、腸充血

3 小結(jié)與討論

3.1 本病例經(jīng)臨床癥狀觀察、病理剖檢初診為育肥豬的“猝死征”，通過需氧和厭氧細(xì)菌分離，分離鑒定出兩株細(xì)菌，分別命名為JXV-E1203、JXVC1203。JXV-E1203經(jīng)生化鑒定為大腸桿菌，小鼠攻毒具有較強(qiáng)的毒力，每只小鼠攻毒3×106CFU/只，即可至死；而且死亡小鼠均表現(xiàn)出腸道出血。厭氧分離菌株JXV-C1203在牛奶培養(yǎng)基培養(yǎng)表現(xiàn)出“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，在血平板上厭氧培養(yǎng)呈雙溶環(huán)血環(huán)，為革蘭氏陽性大桿菌，初步判斷為魏氏梭菌。JXVC1203雖未做攻毒試驗(yàn)，但其溶血十分嚴(yán)重，可能也有致病力。

3.2 “肥豬猝死征”是一種病原較復(fù)雜的疾病，其病因與應(yīng)激相關(guān)，病原相對復(fù)雜，一般認(rèn)為與魏氏梭菌相關(guān)，但常有其它細(xì)菌混合感染。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)出血變化是其特征，病原分離得到魏氏梭菌和大腸桿菌，這與以往報(bào)道主要是魏氏梭菌與巴氏桿菌混合感染有所不同。

該病目前雖不是常見病，但來勢兇猛，常發(fā)于成年動物，損失也比較嚴(yán)重。臨床表現(xiàn)出癥狀后難以治療，且死亡率很高，應(yīng)引起養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)技術(shù)人員的重視。魏氏梭菌常與其它菌混合感染，如臨床上已分離到巴氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌，但也有單獨(dú)感染的。

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