王津果，隋正紅，周 偉，馬金華，張 淑，常連鵬

（中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東 青島266003）

RSAP是由杜曉華于2006年首次提出的一種新型DNA分子標記技術(shù)，具有步驟簡單、檢測位點較多、成本較低等優(yōu)勢，未獲得全基因組測序結(jié)果以前，在遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建和基因定位等方面具有一定的推廣應(yīng)用價值［1］。張明科［2］進一步研究了該技術(shù)的引物設(shè)計并優(yōu)化了反應(yīng)體系。喬利仙［3］與辛本華［4］先后將該技術(shù)應(yīng)用到重樓屬植物的遺傳多樣性分析與紅藻門紫菜遺傳多樣性及種質(zhì)鑒定方面。

目前，經(jīng)青島湛山灣野生種群選育而來的栽培品系981、07－2已在福建南部海區(qū)［5］、廣東省汕頭市南澳島等地栽培多年［6］，并在浙江、山東及遼寧沿海建立了龍須 菜 （Gracilariopsis lemaneiformis）栽 培 產(chǎn) 業(yè)［7］。栽培品系由于多年的無性繁殖而引起種質(zhì)退化，野生資源由于沿岸改造與人為干擾，其分布面積逐漸減少。因此，為適應(yīng)龍須菜產(chǎn)業(yè)化規(guī)模不斷擴大的現(xiàn)狀，如何保護野生資源的遺傳多樣性并使之可持續(xù)利用變得日益重要。本研究以湛山灣野生群體和栽培品系為材料，運用RSAP技術(shù)從基因組DNA水平上，分析等位基因及頻率、遺傳雜合度、多態(tài)信息含量等，旨在從分子水平上探討龍須菜不同群體的的遺傳差異，為龍須菜種質(zhì)資源的保護和可持續(xù)利用以及遺傳育種工作提供理論依據(jù)。

SCAR標記被廣泛應(yīng)用于一些形態(tài)上難以區(qū)分而且經(jīng)濟價值差異較大的種和品種鑒別及種質(zhì)評價［8］。本研究通過分析RSAP指紋圖譜，以期篩選獲得龍須菜生產(chǎn)上的主要苗種來源981的特異條帶，并將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定可靠、特異性高的SCAR標記。通過利用特異的SCAR標記鑒定優(yōu)良的龍須菜栽培品系981，可以防止或減少使用不合格品系給龍須菜生產(chǎn)造成的損失。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗用龍須菜為2010年10月分別采自青島膠州灣養(yǎng)殖海區(qū)和青島湛山灣的981、07－2和湛山灣野生四分孢子體。將采集來的樣品切片，置于顯微鏡下觀察，在皮層細胞中分布有呈十字形分裂的四分孢子囊的藻株即為四分孢子體［9］。選取10株湛山灣野生四分孢子體與栽培品系981、07－2分別2個樣品，在海水中用消毒毛刷除掉附著的雜藻和泥砂后，用蒸餾水沖洗1次。

1.2 試驗方法

1.2.1 龍須菜基因組DNA的提取 采用天根植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN BIOTECH，北京）提取龍須菜的基因組DNA，紫外分光儀測定濃度，1%瓊脂糖電泳檢測DNA分子的完整性。

1.2.2 RSAP分析 RSAP的分析參照杜曉華等［1］的方法并作了適當(dāng)?shù)母倪M。其中引物由上海生工技術(shù)有限公司合成，引物序列如表1。6個引物可分別與其它任何1個引物組合而得到15對引物，利用這15對引物對14個龍須菜樣品DNA進行PCR擴增。20μL PCR反應(yīng)體系中各反應(yīng)物含量：2μL 10×PCR buffer，30ng 基 因 組 DNA，2.5mmol·L－1MgCl2，0.15 mmol·L－1dNTPs，0.4μmol·L－1引 物，2UTaq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)在杭州朗基96孔精品型PCR儀上進行，反應(yīng)程序為：94℃變性5min，前5個循環(huán)為94℃變性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min；接下來30個循環(huán)為：94℃變性1min，46℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min。結(jié)束后產(chǎn)物進行4℃保存。

擴增產(chǎn)物通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）進 行 分析，銀染［10］。

表1 RSAP分析與SCAR驗證所用的引物Table 1Information of the primers used in RSAP analysis and SCAR verification

1.2.3 RSAP數(shù)據(jù)分析 人工觀察統(tǒng)計電泳條帶，以擴增清晰的帶為標準進行標記分析，將電泳圖譜中的每一條帶的遷移位置記為一個位點，相同遷移位置的擴增帶出現(xiàn)時記為1，缺失和模糊不清時記為0，構(gòu)建0－1矩陣。運用PopGen［11］分析種群內(nèi)的遺傳多樣性：觀測到的等位基因數(shù)，Na、有效等位基因數(shù)，Ne、平均基因多樣性指數(shù)，H以及Shannon多樣性信息指數(shù)，I；種群間的遺傳多樣性：種群內(nèi)總的基因多樣性，Ht、種群內(nèi)的基因多樣性，Hs、種群間的基因分化度，Gst、基因流，Nm；計算出遺傳距離，D，采用MEGA5.0軟件按UPGMA法進行聚類。

1.2.4 981特異條帶目的回收與測序 將篩選到的特異條帶，按照 Poly－gel DNA extraction kit（OMEGA，上海）說明進行聚丙烯酰胺凝膠膠回收。以回收回來的DNA片段為模板，進行20μL×5的放大PCR，擴增程序參照RSAP的反應(yīng)程序。放大PCR的產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖電泳檢測，100μL PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳后，運用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit按照說明書進行回收。

目的片段的連接按照pMDTM18－T Vector說明書進行連接。轉(zhuǎn)化后平板培養(yǎng)，隨機挑取10個陽性克隆進行目的片段檢測。陽性克隆在1mL含Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，加終濃度20%甘油，經(jīng)由上海生工3730測序儀進行單向測序。

1.2.5 SCAR引物的設(shè)計與驗證 使用NCBI的Vec Screen對測序后的DNA片段在線去除載體序列，然后在GenBank里面比對是否有同源序列。此外，將整理過的序列載入軟件Primer Premier 5.0，根據(jù)引物設(shè)計原則，在序列兩端設(shè)計特異引物，并送上海生工合成。參照1.1提取981、07－2各2株和30株湛山灣野生四分孢子體的基因組DNA，確定SCAR引物的退火溫度并進行驗證PCR，程序如下：94℃變性5min；94℃變性1min，54℃（SCAR引物1）／65℃（SCAR引物2）退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行目的片段的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RSAP擴增結(jié)果

15對引物在10株湛山灣野生四分孢子體、2個981樣品、2個07－2樣品共計14個樣品中擴增出669個位點。龍須菜14個樣品的RSAP聚丙烯酰胺凝膠電泳擴增條帶情況見圖1。

圖1 龍須菜14個樣品的RSAP聚丙烯酰胺凝膠電泳擴增結(jié)果圖示Fig.1 RSAP amplification result of 14samples of G.lemaneiformis resolved by PAGE analysis

由圖1可見，青島湛山灣野生四分孢子體與栽培品系981、07－2的RSAP擴增片段大小在100～1 000bp，群體間差異條帶少，群體內(nèi)各個體間的差異條帶更少。

2.2 龍須菜各群體內(nèi)的RSAP分析

湛山灣野生和栽培品系981、07－2種群內(nèi)的平均觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、平均基因多樣性指數(shù)即平均雜合度（H）以及Shannon多樣性信息指數(shù)（I）、多態(tài)性位點比率（P／%）見表2。

表2 各群體內(nèi)的遺傳多樣性Table 2 The diversity of every group

由表2可以看出，各群體內(nèi)多態(tài)性位點比率（P／%）都很低，最低的為栽培品系981，多態(tài)性比率不到0.2%，栽培品系07－2多態(tài)性位點比率最高，為0.9%，這反應(yīng)了龍須菜各群體內(nèi)部遺傳變異水平是非常低的。各群體的有效等位基因數(shù)Ne在1.002 1～1.007 1之間，湛山灣野生群體與栽培品系有效等位基因數(shù)差別不大，有效等位基因數(shù)最大的是湛山灣野生群體，達到了1.007 1。各群體內(nèi)的基因多樣性指數(shù)H在0.001 2～0.003 7之間，該指數(shù)的值也是較低的。Shannon指數(shù)I，分布在0.001 8～0.005 4之間，最大的為栽培品系07－2。I值表示群體的基因變異程度，各群體的I值普遍很低，說明了各群體的基因變異程度低。各群體的有效等位基因數(shù)Ne和基因多樣性指數(shù)H 以及Shannon指數(shù)I的變化趨勢是一致的。

2.3 湛山灣野生與栽培品系981、07－2種群間RSAP分析

種群內(nèi)總的基因多樣性Ht、種群內(nèi)的基因多樣性Hs、種群間的基因分化度Gst、基因流Nm見表3。所有群體內(nèi)總的基因多樣性Ht為0.095 3，大于各群體內(nèi)的基因多樣性系數(shù) Hs為（0.002 9），而湛山灣野生與2個栽培品系群體之間兩兩分析結(jié)果顯示，任何2個群體的總基因多樣性均小于0.01。由此可見，各群體間的基因多樣性主要來自湛山灣的樣品和栽培品系樣品之間的差異。所有群體間的基因流為0.015 5，小于1，表現(xiàn)出很低的基因流動性，表明群體間幾乎不存在基因流動。各群體間的基因分化度Gst也均大于0.5，說明在所有檢測的樣品中，遺傳多樣性多來自不同群體間的多樣性。

湛山灣野生與2個栽培品系981、07－2群體個體間的遺傳距離見表4，利用UPGMA方法對龍須菜野生群體與2個栽培品系進行聚類分析，相應(yīng)的UPGMA聚類樹見圖2。

圖2 龍須菜群內(nèi)總的UPGMA法遺傳聚類圖Fig.2 The UPGMA dendrogrom of all the strains of G.lemaneiformis using genetic distance

表3 種群間的基因多樣性Table 3 Gene diversity of inter－groups of G.lemaneiformis

表4 14個個體間的遺傳距離Table 4 Genetic distance between 14 G.lemaneiformis

由圖2可以看出，1～10號樣品為一個群體，11～12號樣品為一個群體，13～14號樣品為一個群體，與14個樣品分屬于3個不同群體相一致，1～10號為屬于湛山灣野生群體，11～12號屬于栽培品系981、13～14號屬于栽培品系07－2。由聚類圖可以看出，各群體間的遺傳距離小，群體間遺傳距離最長在0.17左右，而群體內(nèi)的遺傳距離均低于0.01。

2.4 目的片段的回收、測序以及SCAR引物設(shè)計與驗證

圖3 SCAR引物2對龍須菜新個體的驗證PCR電泳圖Fig.3 Agarose gel profile of G.lemaneiformis individuals amplified with the SCAR primer 2

將篩選得到的栽培品系981特異的片段回收測序后，得到大小分別為620bp、542bp的2條片段。在序列兩端設(shè)計SCAR引物，引物信息見表1。SCAR引物2對981、07－2各3株和30株湛山灣野生四分孢子體共計36株龍須菜的擴增結(jié)果如圖3，擴增片段大小為442bp，SCAR引物1擴增結(jié)果與SCAR引物2擴增結(jié)果一致，片段大小為616bp。結(jié)果表明，2對特異SCAR引物對981基因組DNA可以擴增出預(yù)期大小的特異條帶，而在07－2和湛山灣野生四分孢子體中均無擴增條帶。

3 討論

RSAP技術(shù)的PCR擴增程序借鑒了SRAP［12］技術(shù)，引物的設(shè)計借鑒了RAPD［13］隨機序列的模糊匹配原理。從操作步驟上講，RSAP技術(shù)是AFLP［14］的極大簡化；從基因組的擴增區(qū)域上講，RSAP是對SRAP和TRAP［15］的有效補充。因為后兩者主要針對單拷貝區(qū)擴增，而RSAP擴增的限制性位點則散布于整個基因組區(qū)（包括重復(fù)區(qū)和單拷貝區(qū)）。RSAP標記技術(shù)是一個操作簡單、產(chǎn)率中等、可靠穩(wěn)定、適用性較廣的一種分子標記技術(shù)，已經(jīng)在植物的多種研究中成功應(yīng)用［1－4］。

采用1條RSAP引物，無論含6bp或含4bp的限制性位點識別序列的引物進行PCR擴增，均不能擴增或很少擴增出條帶；而采用2條不同的引物組合進行PCR擴增時，可獲得豐富的擴增譜帶［1］。因此本試驗中僅采用了由6條引物組合而成的15對引物。另外，在RSAP條帶統(tǒng)計過程中，本研究只對條帶的出現(xiàn)與否進行了統(tǒng)計，而未對條帶的強弱進行分析，實際擴增條帶的強弱在一定程度上也能反映DNA水平的變化，如拷貝數(shù)的多少等［16］。而在相關(guān)文獻中，把擴增條帶的強度差異作為區(qū)分不同樣本的報道并不多見，因此本試驗中進行RSAP條帶統(tǒng)計時，也只將條帶的有無作為是否多態(tài)性位點的標準。

RSAP結(jié)果分析表明，湛山灣二倍體野生群體與兩個栽培品系981、07－2，各群體內(nèi)的多態(tài)性比率都非常低，最低的栽培品系981的僅為0.15%，而湛山灣野生群體與栽培品系07－2的都低于1%，比Pang等［17］分析的青島湛山灣二倍體的龍須菜多態(tài)性比率（14.7%）和丁弘葉等［18］研究所得的青島湛山灣二倍體的龍須菜多態(tài)性比率（33.3%）低；同時各群體的有效等位基因數(shù)也很少，表示群體基因變異程度的Shannon指數(shù)I也非常低，湛山灣野生群體的僅為0.005 1，比Pang等［17］與丁弘葉等［18］的相應(yīng)數(shù)值要低一個數(shù)量級甚至更多。以上數(shù)據(jù)都反映出本試驗中各群體的基因變異程度非常低，這是由于所采用的分子標記技術(shù)RSAP是基于限制性內(nèi)切酶酶切位點的多態(tài)性標記，基因發(fā)生突變的概率本身就很低，如果是特定位點的突變頻率會更低，這就直接導(dǎo)致了在分析同一物種不同群體遺傳多樣性時會出現(xiàn)很低的情況。這也說明了同一物種的遺傳多樣性檢測值與所采用的分子標記技術(shù)相關(guān)。

另外，群體間的RSAP分析結(jié)果顯示，野生群體與兩個栽培品系間的基因流為0.015 5，小于1，基因流動性很低，表明群體間幾乎不存在基因流動。兩兩群體間的基因分化度Gst也均大于0.5接近1，說明各群體間的基因分化程度大。各群體間的遺傳距離很小，遺傳相似系數(shù)很大，盡管2個栽培品系981、07－2間遺傳距離不大，但栽培品系與湛山灣野生群體間的遺傳距離相對較大，而UPGMA聚類分析也明顯將湛山灣野生群體與栽培品系981、07－2區(qū)分開來，表明野生群體與栽培品系間已產(chǎn)生一定的遺傳隔閡。

本試驗中RSAP分析的群體內(nèi)及群體間遺傳多樣性系數(shù)均都很低，也是由于材料本身的原因：龍須菜產(chǎn)生的是不動精子，不能進行遠距離受精；湛山灣二倍體野生群體中的個體均于2010年10月采自青島湛山灣，時空的一致性導(dǎo)致了所采集個體幾乎不與外來個體間發(fā)生雜交互換，缺乏基因的流動；栽培品系981最初是由湛山灣野生個體通過人工選擇而來的，07－2則是在981基礎(chǔ)上進一步經(jīng)過人工誘變選育而來，在生產(chǎn)實踐中一直都通過營養(yǎng)繁殖進行栽培，造成了龍須菜群體內(nèi)由于缺乏等位基因的互換而遺傳多樣性低。針對龍須菜遺傳多樣性低的現(xiàn)狀，一方面有必要通過保護其特殊生長環(huán)境保護龍須菜的野生資源，另一方面加快其遺傳育種進度，同時建立種質(zhì)庫，進而更好地實現(xiàn)對現(xiàn)有龍須菜種群遺傳資源的保護。

目前用SCAR標記進行農(nóng)作物種質(zhì)鑒定在國際上已普遍展開［19］。在國內(nèi)藻類方面，SCAR標記已被廣泛地應(yīng)用于紫菜的種質(zhì)鑒定［20－22］，同時在龍須菜的種質(zhì)鑒定方面也得到了應(yīng)用［18］。栽培品系981生長快速，分支多，耐高溫，速生抗逆，瓊膠含量高且好，屬主要的栽培品種，是從青島湛山灣野生種群經(jīng)過誘變選育而來［23］，與栽培品系07－2、野生個體在外觀上沒有明顯的區(qū)別，但在生長性狀及生化特性上差異顯著［24］，而長期以來并沒有很好的便捷的手段或方法區(qū)分。本試驗中，在對龍須菜野生種群與栽培品系981、07－2進行RSAP遺傳多樣性分析過程中，發(fā)現(xiàn)6條栽培品系981的特異條帶，并將其中兩條帶成功轉(zhuǎn)化為981特異的SCAR標記。該SCAR標記將在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的栽培品系981與其他龍須菜材料區(qū)分，保證栽培苗種的純度，避免使用不合格苗種給龍須菜栽培產(chǎn)業(yè)造成損失，進而更有效地進行大規(guī)模的人工養(yǎng)殖和滿足科研需要。

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