張海晶，金 蘭，于金平，陳大忠

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥研究院，哈爾濱150040 2.東北農業(yè)大學食品學院，哈爾濱150030)

雞冠花為莧科(Amaranthaceae)青葙屬植物雞冠花(Celosia cristata L.)的干燥花序［1］，該植物在世界各地分布廣泛，資源豐富.其藥用歷史悠久，是我國一味傳統(tǒng)的中藥，在抗糖尿?。?］、抗陰道毛滴蟲、止血、抗衰老及保肝等作用［3－7］等方面具有很好的藥理活性.然而，對于該藥材的質量控制的報道極少見，甚至沒有.中藥指紋圖譜是運用現(xiàn)代分析技術對中藥化學信息以圖形的方式進行表征并加以描述，憑借其準確性和可操縱性已經成為國際公認的中藥或天然藥物質量標準控制的最有效手段之一.HPLC具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、流動相選擇性廣等特點，非常適合構建中藥指紋圖譜.HPLC指紋圖譜是目前國際上認可的一種中藥質量評價模式，可以通過把握中藥指紋的特征，評價中藥材的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性，是建立中藥現(xiàn)代質量標準體系的核心技術.本文對雞冠花的HPLC指紋圖譜進行了探討，并對其研究方法學進行考察，從而為該藥材的質量控制提供一個更為可行的依據.

1 實驗材料

Waters 2695高效液相色譜儀(Waters 2996二極管陣列檢測器，Waters Empower Pro色譜工作站)，Dikma C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);LA204電子分析天平(瑞士梅特勒－托利多儀器有限公司);KQ－2500E超聲清洗機.乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純;山奈酚對照品(MUST－10102801，中國食品藥品檢定研究院)、槲皮素對照品(100081－200406中國食品藥品檢定研究院)、木犀草素對照品(111520－200504，中國食品藥品檢定研究院).

雞冠花分別收集于黑龍江、湖南、河北、吉林等地，共10批，經黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院生藥學教研室孫慧峰教授鑒定為莧科青葙屬植物雞冠花(Celosia cristata L.).標本(20110912)保存于黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院.

2 試驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱:Dikma C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈－0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，流速:1.0 mL/min，柱溫:25℃，檢測波長:260 nm，分析時間:90 min，進樣量:20 μL.

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取山奈酚、槲皮素、木犀草素標準品適量，分別加甲醇充分溶解，定容于10 mL的容量瓶中，過0.45μm濾膜過濾后作為對照品溶液.

2.3 供試品溶液制備

將曬干的雞冠花藥材粉碎機粉碎后過60目篩，稱取干燥粉末5.0 g，加入95%的乙醇50 mL，精密稱定質量，超聲提取60 min.放冷，再稱定質量，并用溶劑補足減失的質量，搖勻，濾過，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，溶液過0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液.

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗

取同一份供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，分別記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積.結果各共有峰相對保留時間RSD為0.02%～0.76%，RSD ＜1%，相對峰面積 RSD 為0.07%～1.38%，RSD＜3%，表明儀器性能良好，符合指紋圖譜的要求.

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、3、6、9、12、24 h 進樣檢測，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積.結果各共有峰相對保留時間RSD為0.02% ～0.39%，RSD＜1%，相對峰面積RSD為0.14% ～1.84%，RSD＜3%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好.

2.4.3 重現(xiàn)性試驗

精密稱取同一批樣品6份，制備供試品溶液進行分析，方法同以上實驗.結果各共有峰相對保留時間RSD為0.03% ～0.53%，RSD＜1%，相對峰面積RSD為0.41% ～2.24%，RSD＜3%，表明本方法具有較好的重現(xiàn)性結果，符合指紋圖譜要求.

3 實驗結果

3.1 雞冠花指紋圖譜的建立

分別將對照品溶液及10批雞冠花供試品溶液各20μL注入高效液相色譜儀，按確定的上述色譜條件進行測定，并記錄90 min內的色譜圖.在10批樣品的指紋圖譜中，其相對保留時間及色譜峰較穩(wěn)定的峰有16個，確定為雞冠花共有峰，即1～16號峰.通過與對照品對照，指認了其中3個化合物色譜峰.即9號峰為木犀草素;10號峰為槲皮素;13號峰為山奈酚.具體見圖1、2.

3.2 指紋圖譜相似度評價

根據10批雞冠花的HPLC圖譜，并以1號藥材譜圖作為參照譜進行指紋匹配，S峰為內參比峰計算相對保留時間及峰面積.將所得的AIA格式色譜圖依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》(研究版)軟件，輸出了10批雞冠花指紋圖譜及雞冠花對照指紋圖譜，并以此為基準，進行相似度計算，結果10批不同產地的雞冠花藥材的相似度均大于0.9.具體見圖3.

圖1 樣品色譜圖與標準品色譜圖比較

圖2 雞冠花指紋圖譜共有模式圖

圖3 不同產區(qū)雞冠花HPLC指紋圖譜

4 討論

4.1 檢測波長的選擇

利用Waters 2695－2996高效液相色譜儀，進行全波長掃描，本著色譜信息豐富、出峰的數目適中且各峰之間分離度好的原則，確定260 nm為其檢測波長.

4.2 流動相的確定

本實驗分別考察了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0.1%磷酸水溶液、乙腈－0.1%磷酸水溶液4種系統(tǒng)，并分別以不同的梯度進行洗脫，記錄色譜圖.結果表明，乙腈－0.1%磷酸水溶液進行梯度洗脫，色譜峰信息較多，分離效果好，且基線平穩(wěn).乙腈(A)－0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脫:0～15 min，5% ～20%A;15～35 min，20% ～30%A;35～45 min，30% ～40%A;45 ～60 min，40% ～65%A;60～70 min，65% ～85%A;70 ～90 min，85% ～100%A.

4.3 提取溶劑的考察

本實驗選擇了5種溶劑超生提取進行比較，包括50%甲醇、100%甲醇、水、65%乙醇、95%乙醇.結果表明，不同的溶劑提取所得到的色譜圖的差別較大，水提得到的色譜圖峰數較少，50%甲醇和65%乙醇提取得到的色譜圖基本類似，100%甲醇和95%乙醇提取得到的色譜圖基本類似，但是95%乙醇提取得到的色譜圖的峰分離較好，并且基線較平穩(wěn)，故選擇95%乙醇作為提取溶劑.

5 結語

本實驗采用高效液相色譜法對不同產地雞冠花進行指紋圖譜研究，以多種化學成分的保留時間和峰面積為參數進行整體考察并計算其相似度，建立了不同產區(qū)雞冠花的指紋圖譜并生成雞冠花特征指紋圖譜.通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004A版)軟件對10批不同產地雞冠花指紋圖譜比較分析，確定10批樣品有16個特征指紋峰，各共有峰的相對保留時間穩(wěn)定，但相對峰面積不同，表示不同產地所含的化學成分種類相似，但各成分的含量有所差異.10批雞冠花樣品與共有模式的相似度均大于0.9，表明本實驗所建立的指紋圖譜特征性較強、穩(wěn)定性較好，可為雞冠花藥材的質量控制提供科學的依據和有效的鑒別方法.

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