楊 萍，楊 謙，許 倩

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系，哈爾濱150050;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱150076;3.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，阿拉爾843300)

棘孢木霉(T.asperellum)是重要的生物防治真菌，對(duì)多種植物病原菌具有拮抗作用，能分解纖維素，是重要的生防菌株.近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn):棘孢木霉(T.asperellum)有助于植物抵抗終極腐霉菌(Pythium ultimum)［1］，可 抑 制 奇 異 根 串 珠 霉(Thielaviopsis paradoxa)導(dǎo)致的菠蘿黑腐?。?］，防治群結(jié)腐霉菌產(chǎn)生的根腐病［3］，對(duì)立枯絲核菌有拮抗作用［4］，可抑制菠蘿上的奇異根串珠霉(Thielaviopsis paradoxa)［5］.另外，利用棘孢木霉(T.asperellum)處理的菌核菌的菌絲體和細(xì)胞壁發(fā)生變化，且處理后的菌核菌致病力明顯降低［6－8］.棘孢木霉(T.asperellum)與菌根真菌共同作用可促進(jìn)植物防御體系，抵抗黑莢果?。?］.

目前，對(duì)于棘孢木霉(T.asperellum)生防代謝物的研究主要有三種，分別為細(xì)胞壁水解酶幾丁質(zhì)酶，外切β－1，3－葡聚糖酶，N－乙酰氨基葡萄糖苷酶.宋金柱對(duì)棘孢木霉(T.asperellum)生防相關(guān)幾丁質(zhì)酶基因的克隆和表達(dá)進(jìn)行了研究［10］.Nguyen等對(duì)棘孢木霉(T.asperellum)幾丁質(zhì)酶的抗菌活性進(jìn)行了研究，研究表明棘孢木霉(T.asperellum)幾丁質(zhì)酶有強(qiáng)烈的降解微生物細(xì)胞壁的功能.Kumar等從棘孢木霉(T.asperellum)UTP－16中克隆得到外切幾丁質(zhì)酶基因［11］.Marcello等克隆得到了外切 β －1，3 － 葡聚糖酶基因［12］.Ramot等分離得到兩個(gè)N－乙酰氨基葡萄糖苷酶［13］.對(duì)于棘孢木霉(T.asperellum)其他水解酶和抗生素的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.

1 菌株

棘孢木霉(T.asperellum)T4菌株保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號(hào)為:CGMCC3.14975;立枯絲核菌(R.solani)、楊樹爛皮病菌(Cytospora chrysosperma)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、楊樹葉枯病菌(Alternaria alternata)均為哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存.

2 實(shí)驗(yàn)方法

立枯絲核菌細(xì)胞壁的制備:將立枯絲核菌(R.solani)接種于PDA平板上于28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，在平板上打孔取菌塊，轉(zhuǎn)接到PD液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，用無(wú)菌水清洗菌體數(shù)次，棄上清液，沉淀物吸干水分，用液氮冷凍后研磨成粉末狀，于121℃條件下滅菌15 min，即得病原菌細(xì)胞壁.

粗酶液制備:用PD培養(yǎng)基從培養(yǎng)5～7 d的PDA平板上洗下棘孢木霉野生型的分生孢子，稀釋至孢子濃度為107個(gè)/mL，取1 mL的孢子懸液至1.5 mL離心管中，28℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，接種至100 mL的細(xì)胞壁誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間后，取1 mL培養(yǎng)液經(jīng)5 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液.

β－1，3葡聚糖酶酶活的測(cè)定:取0.1 mL粗酶液(以經(jīng)煮沸5min的粗酶液作為陰性對(duì)照)加入0.1%的昆布多糖溶液0.4 mL，在40℃條件下水浴30 min，沸水浴 5 min滅酶，然后加入 0.25 mLDNS，沸水浴5 min，立刻用流動(dòng)水冷卻，于530 nm處比色，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出酶活力，實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)重復(fù).

纖維素酶酶活的測(cè)定:取0.5 mL粗酶液(以經(jīng)煮沸5 min的粗酶液作為陰性對(duì)照)加入0.5%CMC溶液1 mL，在50℃條件下水浴30 min，加入2 mL DNS，沸水浴10 min，立刻用流動(dòng)水冷卻，于530 nm處比色，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出酶活力，實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)重復(fù).

幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定參照參考文獻(xiàn)［14］;N－乙酰－氨基葡萄糖苷酶酶活的測(cè)定參照參考文獻(xiàn)［15］.

棘孢木霉抗真菌代謝物對(duì)病原菌的抑制作用:用無(wú)菌水洗下培養(yǎng)7 d的棘孢木霉的分生孢子，分別取1×107個(gè)/mL的孢子懸浮液1 mL接種至200 mL PD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，離心取上清液，用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，得到棘孢木霉野生型的發(fā)酵液.取發(fā)酵液與冷卻至50℃的2×PDA培養(yǎng)基混勻倒平板，冷卻后在培養(yǎng)基中間分別放四種致病菌的菌餅，置于28℃培養(yǎng)5 d，以無(wú)菌水處理作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)重復(fù).

棘孢木霉抗生素6－戊基－α－吡喃酮產(chǎn)量的測(cè)定:采用氣相色譜質(zhì)譜分析，參照參考文獻(xiàn)［16］.

3 結(jié)果與討論

3.1 不同碳源條件下棘孢木霉幾丁質(zhì)酶的酶活

將活化的棘孢木霉接種至1%不同碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)6、12、24、48 h取樣，測(cè)定幾丁質(zhì)酶的酶活，幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量如圖1.

幾丁質(zhì)酶是催化幾丁質(zhì)水解生成N－乙酰－氨基葡糖苷反應(yīng)的酶.幾丁質(zhì)是病原菌細(xì)胞壁的主要成分之一，棘孢木霉可以通過(guò)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶來(lái)水解病原菌細(xì)胞壁.從圖1可以看出:在兩種碳源誘導(dǎo)情況下，幾丁質(zhì)酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在誘導(dǎo)12 h之后以立枯絲核菌細(xì)胞壁為碳源的幾丁質(zhì)酶活性迅速增加，明顯高于幾丁質(zhì)為碳源的情況，說(shuō)明立枯絲核菌細(xì)胞壁水解物對(duì)棘孢木霉幾丁質(zhì)酶活性有誘導(dǎo)作用.

圖1 不同碳源誘導(dǎo)條件下棘孢木霉幾丁質(zhì)酶酶活變化

3.2 不同碳源條件下棘孢木霉N－乙酰－氨基葡萄糖苷酶的酶活

將活化的棘孢木霉接種至1%不同碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)6、12、24、48 h取樣，測(cè)定N－乙酰－氨基葡萄糖苷酶的酶活，測(cè)定N－乙酰－氨基葡萄糖苷酶的活性，其產(chǎn)量如圖2所示.

圖2 不同碳源誘導(dǎo)條件下棘孢木霉N－乙酰－氨基葡萄糖苷酶酶活變化

N－乙酰氨基葡萄糖苷酶是既能水解N－乙酰－氨基葡萄糖苷，也能水解N－乙酰－氨基半乳糖苷的酶.從圖2可以看出:在三種碳源誘導(dǎo)情況下，N－乙酰－氨基葡萄糖苷酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加;在誘導(dǎo)12 h之前，N－乙酰氨基葡萄糖苷為碳源的情況下，N－乙酰－氨基葡萄糖苷酶活性明顯高于立枯絲核菌細(xì)胞壁和膠態(tài)幾丁質(zhì)為碳源的情況，在誘導(dǎo)12 h之后，以立枯絲核菌細(xì)胞壁為碳源的N－乙酰－氨基葡萄糖苷酶活性迅速增加，高于其他兩種碳源，說(shuō)明立枯絲核菌細(xì)胞壁水解物可以誘導(dǎo)N－乙酰－氨基葡萄糖苷酶活性.

3.3 不同碳源條件下棘孢木霉N－乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶活

將活化的棘孢木霉接種至1%不同碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)6、12、24、48 h取樣，測(cè)定β－1，3葡聚糖酶的酶活，測(cè)定β－1，3葡聚糖酶的活性，產(chǎn)量如圖3.

圖3 不同碳源誘導(dǎo)條件下棘孢木霉β－1，3葡聚糖酶酶活變化

β－1，3葡聚糖是病原菌細(xì)胞壁的主要成分之一，棘孢木霉通過(guò)產(chǎn)生β－1，3葡聚糖酶來(lái)水解病原菌細(xì)胞壁.從圖3可以看出:在兩種碳源誘導(dǎo)情況下，β－1，3葡聚糖酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在誘導(dǎo)6 h之后，以立枯絲核菌細(xì)胞壁為碳源的β－1，3葡聚糖酶活性迅速增加，明顯高于纖維素為碳源的情況，說(shuō)明立枯絲核菌細(xì)胞壁水解物對(duì)棘孢木霉β－1，3葡聚糖酶活性有誘導(dǎo)作用.

3.4 不同碳源條件下棘孢木霉N－乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶活

將活化的棘孢木霉接種至不同碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)6、12、24、48 h取樣，測(cè)定纖維素酶的酶活，產(chǎn)量如圖4.

圖4 不同碳源誘導(dǎo)條件下棘孢木霉纖維素酶酶活變化

病原菌細(xì)胞壁中含有少量纖維素.纖維素酶是水解纖維素成小分子物質(zhì)的酶，棘孢木霉通過(guò)分泌纖維素酶水解病原菌細(xì)胞壁中的纖維素，破壞病原菌細(xì)胞壁.纖維素酶是由多種水解酶組成的一個(gè)復(fù)雜酶系，人們習(xí)慣將纖維素酶分成三類:C1酶、Cx酶和β－葡糖苷酶，C1酶是破壞纖維素鏈的結(jié)晶結(jié)構(gòu)的酶;Cx酶是作用于經(jīng)C1酶活化的纖維素、分解其β－1，4－糖苷鍵的酶;β－葡糖苷酶可以將纖維二糖、纖維三糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖.

從圖4可以看出:在兩種碳源誘導(dǎo)情況下，纖維素酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在誘導(dǎo)6 h之后，以立枯絲核菌細(xì)胞壁為碳源的纖維素酶活性迅速增加，明顯高于纖維素為碳源的情況，說(shuō)明立枯絲核菌細(xì)胞壁水解物對(duì)棘孢木霉纖維素酶活性有誘導(dǎo)作用.

圖5 棘孢木霉代謝物對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制作用

3.5 棘孢木霉代謝物對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制

切取預(yù)培養(yǎng)5 d的立枯絲核菌，尖孢鐮刀菌，楊樹爛皮病菌和楊樹葉枯病菌分別接種于含棘孢木霉發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，以無(wú)菌水處理作為對(duì)照，結(jié)果如圖5所示.

從圖5可以看出:棘孢木霉的代謝產(chǎn)物對(duì)四種致病菌生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，對(duì)立枯絲核菌，尖孢鐮刀菌和楊樹葉枯病菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)楊樹爛皮病菌的抑制作用較弱，說(shuō)明棘孢木霉代謝產(chǎn)物中含有抗真菌作用的物質(zhì).

3.6 棘孢木霉產(chǎn)生的抗生素6－戊基－α－吡喃酮的產(chǎn)量

切取預(yù)活化的棘孢木霉菌餅接種至覆蓋玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，去除玻璃紙，用乙酸乙酯萃取培養(yǎng)基中的抗生素，無(wú)水硫酸鈉去除水分，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，取1μL樣品進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析.與標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)比，6－戊基－α－吡喃酮標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為7.72 min.棘孢木霉代謝產(chǎn)生的6－戊基－α－吡喃酮的量為1.32 mg/g菌絲干重.

4 結(jié)語(yǔ)

棘孢木霉(T.asperellum)是重要的生物防治菌，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用、抗生作用、誘導(dǎo)植物抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和協(xié)同拮抗等機(jī)制防治植物土傳病菌的危害。在生物防治過(guò)程中產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，本文對(duì)與生物防治相關(guān)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，得出了在不同碳源誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞壁水解酶幾丁質(zhì)酶、外切β－1，3－葡聚糖酶、N－乙酰氨基葡萄糖苷酶和纖維素酶都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加;棘孢木霉代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、楊樹爛皮病菌和楊樹葉枯病菌都有抑制作用，并確定了了棘孢木霉代謝產(chǎn)生的抗生素6－戊基－α－吡喃酮的產(chǎn)量為1.32 mg/g菌絲干重.

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