李 健，呂 博，劉 寧，黎晨晨

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150076)

豆腐黃漿水是豆腐生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，又稱豆腐廢水，主要來源于熱豆?jié){凝固、制坯壓榨出來的泔水.由于黃豆中含有可溶于水的黃酮和胡蘿卜素類色素，在磨豆、凝固、制坯過程中少量的黃色素被帶到泔水中，使泔水呈黃色，所以也稱為黃泔水［1］.豆腐黃漿水中含有大量營養(yǎng)素，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.377%，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.313%，其中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%、粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%、大豆異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.014%，鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.048%鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%，鎂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%，鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%，磷酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%，氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.035%.此外，黃漿水中還含有維生素P、K及其他營養(yǎng)成分［2］.江南等地利用黃漿水作為凝固劑制作豆腐有悠久的歷史.漿水富含有機(jī)酸，其有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和種類維持漿水的酸堿平衡，影響漿水的口感以及生物穩(wěn)定性［3－4］.通過一定技術(shù)手段將豆腐黃漿水充分利用起來，不僅減少了處理這些副產(chǎn)物的工序和成本，更是變廢為寶，提高資源利用率.因此，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對黃漿水中的有機(jī)酸及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行分析，為發(fā)酵黃漿水制備豆腐凝固劑奠定了基礎(chǔ)，為改善豆腐品質(zhì)提供了依據(jù)，提高了資源利用率.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

同一批次豆腐黃漿水:市售.

1.1.1 主要儀器與設(shè)備

Agilent液相色譜儀(配備紫外檢測器)，美國安捷倫公司;TU－1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司;離心機(jī)(型號LD4－2A)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;超聲波清洗器(型號AS3120A)，AUTO SCIENCE;針頭過濾器，美國安捷倫公司;0.45μm合成纖維樹脂濾膜;超純水機(jī)(Ultra Pure)，上海和泰儀器有限公司.

1.1.2 試劑

甲醇(色譜純)，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠;磷酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥85.0%)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司;磷酸二氫鉀(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司;蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、草酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品，成都瑞芬思生物科技有限公司;試驗(yàn)用水為重蒸水，經(jīng)0.45μm濾膜真空抽濾.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 流動相的配制

0.01 mol/LKH2PO4－H3PO4緩沖溶液:取85%濃磷酸34 mL溶于重蒸水中，定容至500 mL容量瓶中備用.稱取KH2PO40.682 2 g，用重蒸水溶解并定容至500 mL容量瓶中.用磷酸調(diào)pH值至2.85，然后用0.45μm水相濾膜過濾，臨用前用超聲波脫氣.

1.2.2 有機(jī)酸標(biāo)樣的配制

分別準(zhǔn)確稱取草酸20 mg、酒石酸20 mg、蘋果酸20 mg、檸檬酸20 mg、琥珀酸20 mg、富馬酸20 mg，用重蒸水溶解并分別定容到6個10 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)酸原液，密封置于4℃冰箱中保存待用，按照表1配制混合酸標(biāo)樣.

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中6種有機(jī)酸的質(zhì)量濃度

1.2.3 樣品處理

取豆腐黃漿水10 mL，經(jīng)過濾后用離心機(jī)在4 000 r/min 下離心 20 min［5］，取上清液 1 mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，超聲脫氣后供分析用.

1.2.4 色譜條件

Agilent Eclipse XDB －C18色譜柱(4.6mm ×150mm，5μm);檢測器為紫外檢測器，檢測波長為210 nm;流動相為甲醇∶0.01 mol/L KH2PO4－H3PO4緩沖溶液(3∶97，pH 值為2.85);流速為0.8 mL/min;柱溫為25℃;進(jìn)樣量為20μL.

1.2.5 有機(jī)酸定性定量方法

有機(jī)酸采用保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量.

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 紫外檢測波長的確定

采用紫外可見分光光度計(jì)采集6種有機(jī)酸的吸收光譜圖，如圖1所示，蘋果酸在192 nm處出現(xiàn)吸收峰，但在210 nm處也有吸收.草酸、檸檬酸、酒石酸、富馬酸均在波長越小，吸收越強(qiáng).琥珀酸分別在191 nm、214 nm處有最大吸收峰.綜合六種有機(jī)酸的吸收程度選擇210 nm為檢測波長.

圖1 有機(jī)酸紫外吸收光譜圖

2.1.2 流動相的確定

反相高效液相色譜法中，流動相一般以極性強(qiáng)的液體為基礎(chǔ)溶劑，并加入甲醇等極性調(diào)節(jié)劑.甲醇的性質(zhì)及其與基礎(chǔ)溶劑的混合比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著的影響.多數(shù)緩沖溶液在210 nm左右均有吸收，但是磷酸鹽緩沖溶液作為一種弱酸電離抑制劑在210 nm左右?guī)缀鯚o吸收，分離效果好，故可以作為本試驗(yàn)分析有機(jī)酸的流動相，所以本試驗(yàn)選擇KH2PO4作為緩沖溶液.由于緩沖溶液質(zhì)量濃度越高，酸的存在形式就越穩(wěn)定［6］，但是較高質(zhì)量濃度的緩沖鹽溶液離子強(qiáng)度大，對組分分離不利，對泵和色譜柱的壽命都有一定的影響，降低了靈敏度，而較低的質(zhì)量濃度又不利于分離，所以選擇0.01 mol/L的緩沖鹽溶液.本試驗(yàn)采用甲醇－磷酸鹽緩沖溶液作為流動相.甲醇與磷酸鹽緩沖溶液比例分別為 1∶99、3∶97、5∶95.分析不同比例的甲醇與磷酸鹽緩沖溶液的配比對混合有機(jī)酸的分離效果的影響，并且隨著甲醇的加入，有機(jī)酸的疏水端基團(tuán)和固定相間的相互作用減弱，有機(jī)酸保留時(shí)間降低，并可以改善色譜峰型［7］，當(dāng)甲醇:0.01mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液=3∶97時(shí)，六種有機(jī)酸分離效果和峰型較理想.

2.1.3 流動相pH值的確定

流動相的pH值對有機(jī)酸的分離有較大的影響，通過調(diào)節(jié)流動相的pH值可以抑制解離，增加保留時(shí)間［8－9］，所以本試驗(yàn)對流動相的pH值進(jìn)行了確定，用 H3PO4調(diào)節(jié)流動相的 pH值分別為2.80、2.85、2.90、2.95 和3.00，各有機(jī)酸保留時(shí)間如圖2所示.在pH值為2.8時(shí)草酸、酒石酸分離效果較差;pH值為2.95和3.0時(shí)，蘋果酸、富馬酸保留時(shí)間相近，不能有效的分離.由于pH值小于2.8的溶液會影響色譜柱的壽命，所以選擇用KH2PO4－H3PO4(pH值為2.85)緩沖溶液作為流動相.

圖2 pH值對有機(jī)酸保留時(shí)間的影響

2.1.4 流速的確定

流動相的流速影響出峰時(shí)間，本試驗(yàn)討論了流速分別為 0.4 、0.6、0.8、1.0 mL/min 下有機(jī)酸的分離效果，隨著流速增加，有些成分不能完全分離;流速降低，會造成托峰現(xiàn)象，導(dǎo)致兩相鄰成分分離效果不好.又由于流速為1.0 mL/min時(shí)，有機(jī)酸分離效果較差，柱壓升高，降低色譜柱壽命，因此選擇流動相流速為0.8 mL/min.

2.1.5 柱溫的選擇

色譜柱的柱溫對有機(jī)酸的分離、保留時(shí)間有一定的影響，隨著柱溫的升高，各有機(jī)酸的保留時(shí)間降低，但是對峰型和分離效果的影響不大.因此，選擇柱溫為25℃.

2.2 混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析

根據(jù)上述確定的最佳色譜分離條件為:檢測波長為210 nm;流動相為甲醇∶0.01 mol/L KH2PO4－H3PO4緩沖溶液(3∶97，pH 值為 2.85);流速為0.8 mL/min;柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量為 20 μL.在此色譜條件下，各種有機(jī)酸得到有效的分離(如圖3所示).

2.3 有機(jī)酸線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

取各不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以20.0 μL進(jìn)樣量進(jìn)行分析，以各種有機(jī)酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，混合標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得到6種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù).以信噪比等于3為標(biāo)準(zhǔn)，測得草酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸和富馬酸檢出限列于表2.

圖3 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

表2 6種有機(jī)酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 精密度與重復(fù)性試驗(yàn)

從同一批次的豆腐黃漿水中平行取5份樣品進(jìn)行精密度與重復(fù)性試驗(yàn)，各種有機(jī)酸質(zhì)量濃度、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)結(jié)果如表3、4所示.可見，本方法的重現(xiàn)性較好.但存在偶然誤差，影響了樣品的分離，重現(xiàn)性也受到影響.此情況可以通過多次測量來解決.

表3 豆腐黃漿水各種酸精密度試驗(yàn)結(jié)果

表4 豆腐黃漿水各種酸重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 豆腐黃漿水色譜分析

按照1.2.3處理后的樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示.

圖4 豆腐黃漿水中有機(jī)酸色譜圖

3 結(jié)論

1)由上述試驗(yàn)確定高效液相色譜測定有機(jī)酸的最佳條件為:Agilent Eclipse XDB－C18色譜柱(4.6mm ×150mm，5μm);檢測器為紫外檢測器，檢測波長為 210 nm;流動相為甲醇∶0.01 mol/L KH2PO4－H3PO4緩沖溶液(3∶97，pH 值為 2.85);流速為0.8 mL/min;柱溫為25℃;進(jìn)樣量為20 μL.

2)此方法的操作可行性比較強(qiáng)、可以同時(shí)并快速的檢測樣品中的有機(jī)酸，不論是從精密度還是重復(fù)性，均可以確定.

3)因?yàn)槎垢S漿水中的成分復(fù)雜，各種有機(jī)酸在豆腐黃漿水中的配比稍有差異，與有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的各種酸配比也不可能完全相同，導(dǎo)致有些有機(jī)酸保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間稍有不同.

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