郭磊 詹亞光 范桂枝

摘要 [目的]建立一套適合白樺懸浮細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析的雙向電泳體系。[方法]以白樺懸浮細(xì)胞為研究對象，采用改進(jìn)的三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法提取懸浮細(xì)胞蛋白，使用17 cm、pH 4.0～7.0的IPG膠條，9.0 μg/μl的上樣量進(jìn)行雙向電泳。[結(jié)果]可得到蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)目多、分辨率高和重復(fù)性好的雙向電泳圖譜。PDQuest軟件分析考馬斯亮藍(lán)染色后的凝膠，共得到約1 000個(gè)蛋白點(diǎn)。從這些蛋白點(diǎn)中隨機(jī)選取3個(gè)蛋白點(diǎn)經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 （MALDI-TOF MS） 分析后，搜索NCBInr 數(shù)據(jù)庫對蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，這3個(gè)蛋白分別為S-腺苷甲硫氨酸合成酶、transposase for IS1330和PadR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。[結(jié)論] 為利用蛋白組學(xué)分析誘導(dǎo)子提高次生代謝物的積累機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 白樺;蛋白組學(xué);懸浮細(xì)胞

中圖分類號 S188;Q943 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11638-03

Establishment of Proteomic Analysis of Suspension Cells in Betula platyphylla Suk.

GUO Lei， ZHAN Ya-guang， FAN Gui-zhi*

（College of Life Science， Northeast Forestry University， Harbin ，Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To establish a two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis （2-D PAGE） system for suspension cell proteomic analysis of Betula platyphylla.[Method]the improved acetic acid （TCA） -acetone precipitation method was applied for suspension cell protein isolation and purification， and the key technologies of electrophoresis including the sample loading quantity and types of IPG strip were optimized. [Reault]The results indicated that the reproducible 2-D gel with more spots and high resolution electrophoresis diagram could be obtained by using the improved TCA-acetone precipitation method， with 9.0 μg/μl of loading protein sample on 17 cm IPG strip with pH 4-7. About 1 000 protein spots were obtained by PDQuest software analysis. 3 randomly selected protein spots were used to identify by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry （MALDI TOF MS）. The identified 3 proteins were S-S-adenosylmethionine synthetase， transposase for IS1330 and transcriptional regulatory proteins of PadR family， respectively. [Conclusion] The study laid the foundation for using proteomics analysis inducer to improve secondary metabolites accumulation mechanism.

Key words Betula platyphylla Suk.; Proteomics; Suspension cell

基金項(xiàng)目 東北林業(yè)大學(xué)本科生創(chuàng)新項(xiàng)目“桑黃發(fā)酵產(chǎn)物中甾醇類物質(zhì)的質(zhì)量控制技術(shù)（20140225107）。

作者簡介 郭磊（1993- ），男，山西常治人，本科生，專業(yè)：生物技術(shù)。*通訊作者，副教授，博士，從事生物工程研究。

收稿日期 2014-10-20

近年來研究表明，白樺（Betula platyphylla Suk.）三萜具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降脂、利膽和保肝等作用，特別是白樺酯醇、白樺酯酸等三萜物質(zhì)作為天然藥物在抗腫瘤和抗HIV等活性上顯示出與以往藥物不同的作用機(jī)制，靶向作用性更強(qiáng)，幾乎無不良反應(yīng)等特點(diǎn)[1-3]。因此，白樺三萜作為藥物化學(xué)中的先導(dǎo)化合物而逐步受到研究者的注視。

前期研究表明，白樺酯醇和齊墩果酸等三萜物質(zhì)可以在白樺愈傷組織和懸浮細(xì)胞中積累，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)極低[4-5]。利用生物和非生物誘導(dǎo)子誘導(dǎo)白樺懸浮細(xì)胞，三萜含量明顯提高，但目前誘導(dǎo)子提高次生代謝物積累的原因尚不明確。

新興的學(xué)科蛋白組學(xué)為進(jìn)一步揭示誘導(dǎo)子的作用機(jī)制提供了可能。蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體蛋白質(zhì)水平上，在一個(gè)更加深入、更加貼近生命本質(zhì)的層次上探討和發(fā)現(xiàn)生命活動的規(guī)律和重要生理、病理現(xiàn)象的本質(zhì)[6-8]。目前，植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)已日漸成熟，然而，利用蛋白組學(xué)在誘導(dǎo)子提高藥用次生代謝物方面的研究報(bào)道卻很少，若能利用蛋白組學(xué)分析誘導(dǎo)子誘導(dǎo)次生代謝物的積累，將有助于從整體和動態(tài)的蛋白質(zhì)水平了解次生代謝物的誘導(dǎo)積累機(jī)制。因此，筆者建立白樺懸浮細(xì)胞的蛋白質(zhì)分析體系，以期為利用蛋白組學(xué)分析誘導(dǎo)子提高次生代謝物的積累機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白樺愈傷組織來自于白樺組培苗的莖段，篩選生長快、分散性好的白樺愈傷組織，將其繼代若干次后轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。通過不斷選擇獲得分散性好的細(xì)胞懸浮物，經(jīng)過6代以上的轉(zhuǎn)接，建立穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系。

培養(yǎng)條件：固體培養(yǎng)基為NT培養(yǎng)基+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L TDZ，蔗糖20 g/L，瓊脂粉5.3 g/L，pH 5.6～5.8。液體培養(yǎng)成分同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂粉。培養(yǎng)基均以121 ℃高壓滅菌20 min，培養(yǎng)溫度為25～27 ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照16 h/d，濕度為40%～50%，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。

取培養(yǎng)9 d的白樺懸浮細(xì)胞，立即放于液氮中速凍，放于-80 ℃ 保存待用。

1.2 樣品的制備

取部分樣品液氮研磨，粉末加入PBS、1 mmol/L PMSF、0.01 g/ml DTT，4 ℃振蕩30 min;14 000 r/min 4 ℃ 離心30 min;上清加5倍體積的TCA-丙酮溶液，-20 ℃過夜沉淀;14 000 r/min 4 ℃ 離心30 min，去上清;加90%丙酮，14 000 r/min 4 ℃ 離心30 min，去上清，重復(fù)1次，室溫晾干沉淀;加適量裂解液回溶，bradford法測量濃度，-80 ℃ 保存。

1.3 雙向凝膠電泳

第1向等電聚焦凝膠電泳（IEF）采用17 cm，pH 3～10 IPG膠條，水化液組成為8 mol/L尿素，2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）CHAPS，40 mmol/L DTT，0.6% （體積分?jǐn)?shù)）Ampholyte （pH 3～10），0.002% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）溴酚藍(lán)?？偵蠘芋w積為500～800 μl，蛋白上樣量為8.8～9.4 μg/μl，水化和等電聚焦在20 ℃下進(jìn)行。其程序?yàn)?～500 V，500 Vh;500 V，2 500 Vh;500～3 500 V，10 000 Vh;3 500 V，50 000 Vh;3 500～500V，8 000 Vh。等電聚焦后的IPG膠條在平衡緩沖液I（50 mmol/L Tris-HCl 6.8 ，6 mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，2% DTT，0.02% 溴酚藍(lán)）中平衡15 min，然后在平衡緩沖液II（50 mmol/L Tris-HCl 6.8 ，6 mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，2.5%IAA，0.02% 溴酚藍(lán)）中平衡5 min。將IPG膠條從樣品水化盤中移出，放到已配好的SDS-PAGE凝膠上端，并將marker放到凝膠的一端，再用0.5%的瓊脂糖將膠條和marker封嚴(yán)，切忌不能產(chǎn)生氣泡。并將膠板固定于電泳槽內(nèi)。在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.4 圖像采集與分析

凝膠用GS-800校準(zhǔn)型光密度儀（Bio-rad）進(jìn)行掃描采集，所獲得的凝膠圖像用PDQuest（Bio-Rad）軟件進(jìn)行初步分析。

1.5 蛋白點(diǎn)的選取、酶解及質(zhì)譜鑒定

從考染凝膠上隨機(jī)選取3個(gè)蛋白點(diǎn)并用槍頭切下后，用胰蛋白酶（Trypsin）進(jìn)行酶解，肽段經(jīng)MALDI-TOF MS 分析后得到肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）數(shù)據(jù)，將這些數(shù)據(jù)遞交至MASCOT（http：//www.matrjxscience.corn）搜索引擎中，蛋白鑒定所使用的數(shù)據(jù)庫為NCBInr數(shù)據(jù)庫，主要參數(shù)設(shè)置與Yuan等的方法相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品制備

樣品制備是2-DE 成功與否的一個(gè)關(guān)鍵因素。對于木本植物白樺而言，次生代謝物如酚類、多糖等對蛋白質(zhì)的提取影響很大。在參照木本植物TCA-丙酮提取方法的基礎(chǔ)上，主要對預(yù)處理時(shí)的低溫和細(xì)胞破碎方法進(jìn)行調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)將懸浮細(xì)胞、研杵、研缽在-70 ℃低溫預(yù)冷8 h 以上，采用液氮加少許石英砂和PVP的方法，蛋白質(zhì)的提取量由5.02 mg/ml上升到5.79 mg/ml，同時(shí)得到了高分辨率的圖片（圖1）。

2.2 IPG膠條pH范圍的確定

為進(jìn)一步了解白樺懸浮細(xì)胞蛋白在2-DE圖譜上的分布， 在上樣量均為9.4 μg/μl 蛋白提取液的基礎(chǔ)上，使用2 種pH分別是4.0～7.0和3.0～10.0的17 cm 線性膠條，發(fā)現(xiàn)大部分蛋白點(diǎn)集中于pH 4.0～7.0，而在堿性端檢測到的蛋白較少（圖1A）。pH 4.0～7.0 的膠條提高了酸性蛋白在凝膠上的分辨率，蛋白點(diǎn)的分布較為均勻，且多數(shù)蛋白點(diǎn)呈圓形，邊界清晰。而pH 3.0～10.0膠條走出的蛋白點(diǎn)由于過于擁擠而呈雨點(diǎn)狀。因此，在17 cm膠條的情況下，分離白樺懸浮細(xì)胞蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)采用pH 4.0～7.0的膠條。

注：A. pH 4～7 ;B. pH 3～10。

圖1 不同pH梯度IPG膠條對蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響

2.3 上樣量的確定

采用pH 4.0～7.0 的IPG線性膠條，分析8.8、9.0和9.4 μg/μl的上樣量對白樺懸浮細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳分辨率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)上樣量為8.8 μg/μl 時(shí)，蛋白點(diǎn)雖然無拖尾現(xiàn)象，但點(diǎn)數(shù)明顯偏少，約900個(gè)點(diǎn)（圖2A）;上樣量為9.0 μg/μl 時(shí)， 檢測出的蛋白點(diǎn)數(shù)達(dá)到1 000多個(gè)，整個(gè)凝膠圖上的多數(shù)蛋白點(diǎn)呈圓形，邊界清晰，分布較均勻，一些低豐度蛋白清晰可見（圖2B）。上樣量為9.4 μg/μl 時(shí)，蛋白檢出率與上樣量為9.0 μg/μl時(shí)無明顯差別， 但一些高豐度蛋白在電泳過程中明顯影響其他蛋白質(zhì)，分子量或等電點(diǎn)相近的蛋白點(diǎn)無法有效分開，部分蛋白點(diǎn)有較為明顯的拖尾（圖2C ）。因此，白樺懸浮細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳上樣量為9.0 μg/μl 左右時(shí)，電泳圖譜效果較好。

2.4 蛋白點(diǎn)的等電點(diǎn)（pI）和分子量分析

對2次重復(fù)中可重復(fù)的917個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行pI值（每0.5個(gè)pI范圍為1個(gè)區(qū)間）和分子量（每10 kD為1個(gè)區(qū)間）分布分析，發(fā)現(xiàn)917蛋白點(diǎn)pI值和分子量分布基本上呈正態(tài)分布趨勢（圖3）。其中，大部分蛋白點(diǎn)的都分布于pI 5.0～6.0和分子量20～70 kD。

2.5 蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

從膠上隨機(jī)選取3個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，蛋白鑒定結(jié)果見表1。在鑒定的3個(gè)蛋白點(diǎn)中，沒有來源于白樺樹種的蛋白點(diǎn)，這3個(gè)蛋白點(diǎn)分別來源于Medicago sativa（紫花苜蓿）、Pectobacterium carotovorum subsp.、Lactobacillus jensenii（乳酸菌）物種，編碼S-adenosylmethionine synthase（S -腺苷甲硫氨酸合成酶）、transposase for IS1330、PadR family transcriptional regulator（PadR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控）蛋白。

注：A. 8.8 μg/μl;B. 9.0 μg/μl;C. 9.4 μg/μl。

圖2 不同上樣量下蛋白質(zhì)2-DE 圖譜

圖3 蛋白點(diǎn)的等電點(diǎn)（pI）和分子量（MV）分布

表1 蛋白點(diǎn)的鑒定

3 結(jié)論與討論

在蛋白組學(xué)研究中，高質(zhì)量的2-DE圖譜是蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析的前提，為此在利用蛋白組學(xué)分析某一生物的生理功能時(shí)，需要建立該生物的蛋白組學(xué)分析體系。樣品制備是雙向電泳實(shí)驗(yàn)中最基礎(chǔ)也是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一[9-10]。因白樺懸浮細(xì)胞中脂類、多糖等生物大分子以及鹽類小分子相對較少，且白樺細(xì)胞中蛋白的提取過程中沒有用到鹽溶液，因此白樺懸浮細(xì)胞樣品制備方法較固定，即參照木本植物TCA-丙酮提取法。利用該方法提取的蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，蛋白點(diǎn)呈圓形， 分離均勻，幾乎無橫條紋和拖尾現(xiàn)象，重復(fù)性高， 說明此方法適用于白樺懸浮細(xì)胞蛋白的提取。而且，在采用傳統(tǒng)TCA-丙酮提取法的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)將懸浮細(xì)胞、研杵、研缽在-70 ℃低溫預(yù)冷8 h 以上，蛋白質(zhì)的提取量由5.02 mg/ml上升到5.79 mg/ml。

蛋白質(zhì)組是細(xì)胞內(nèi)或組織中所有蛋白質(zhì)總和，其中蛋白質(zhì)數(shù)量巨大，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)也不同。為了最大限度地捕獲蛋白質(zhì)信息量，首先用pH范圍較寬的IPG膠條（pH 3～10） 等電聚焦，然后根據(jù)雙向電泳圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)主要分布區(qū)域，選擇pH范圍相對較窄的IPG膠條，以增加相應(yīng)區(qū)域蛋白點(diǎn)分辨率[11]。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，白樺懸浮細(xì)胞中的蛋白質(zhì)大多在pH4～7的區(qū)域內(nèi)，與pH 3～10 的IPG 膠條雙向電泳結(jié)果相比，蛋白質(zhì)點(diǎn)分離效果好、數(shù)量較多。該類膠條能充分反映蛋白質(zhì)組信息，為后續(xù)研究的深入開展創(chuàng)造條件。

另外，蛋白質(zhì)上樣量是影響2-DE圖譜清晰度及蛋白質(zhì)點(diǎn)多少的因素之一。上樣量過低，不利于檢測低豐度蛋白質(zhì)，但上樣量過高又會導(dǎo)致蛋白質(zhì)斑點(diǎn)過大，特別對于高豐度蛋白，嚴(yán)重影響其蛋白質(zhì)組分的分離[12-13]。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，白樺懸浮細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳上樣量為9.0 μg/μl 左右時(shí)，電泳圖譜效果較好。

該研究初步構(gòu)建了白樺懸浮細(xì)胞的蛋白組學(xué)分析體系，確定了白樺懸浮細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取方法為TCA-丙酮提取法，并確定了IPG 膠條pH為4.0～7.0，最佳上樣量為9.0 μg/μl，并對分離出的3個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，初步明確了被鑒定蛋白點(diǎn)的種類。該研究將為建立白樺的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫及確定各蛋白質(zhì)的作用模式、功能機(jī)理、調(diào)節(jié)機(jī)制及蛋白質(zhì)之間的相互作用，對于研究白樺的生長發(fā)育機(jī)理、環(huán)境脅迫、遺傳育種等具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

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