楊冬等

摘要：通過(guò)體外酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)合離心超濾LCESIMSn技術(shù)從富含蒽醌類(lèi)成分的中藥虎杖和大黃提取物中篩選α葡萄糖苷酶抑制劑。首先，以4硝基苯αD吡喃葡萄糖苷（PNPG）為底物，對(duì)虎杖和大黃提取物的體外酶抑制活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，虎杖和大黃提取物對(duì)α葡葡萄糖苷酶的半抑制濃度分別為0.027 和0.050 g/L。其次，利用離心超濾技術(shù)對(duì)虎杖和大黃提取物種的潛在的α葡葡萄糖苷酶抑制劑進(jìn)行了篩選，并通過(guò)LCESIMSn對(duì)篩選得到的潛在抑制劑結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示，虎杖和大黃中各鑒定得到12和7種，共計(jì)16種活性小分子成分。其中大黃素等7種化合物屬于蒽醌類(lèi)；虎杖苷等5種化合物屬于多元酚類(lèi)；蓮花掌甘等4種化合物都具有沒(méi)食子酰基取代基。結(jié)果表明，蒽醌類(lèi)化合物具有較好的α葡萄糖苷酶抑制活性，可以為開(kāi)發(fā)新的安全有效的富含蒽醌類(lèi)成分的中藥降糖藥物奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：α葡葡萄糖苷酶； 超濾質(zhì)譜； 虎杖； 大黃； 抑制劑

1引言

糖尿病是一種持續(xù)高血糖，胰島素相對(duì)或絕對(duì)不足，外周組織對(duì)葡萄糖利用減少的一種綜合病癥[1-3]。糖尿病可分為I型糖尿病、II型糖尿病、特異性糖尿病和妊娠糖尿病，其中II型糖尿病占90%以上。α葡萄糖苷酶抑制劑是臨床上治療II型糖尿病的主要藥物之一，可減緩葡萄糖的生成和吸收，降低血糖水平[4，5]。

中藥中α葡葡萄糖苷酶抑制劑的種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，按照其基本的化學(xué)結(jié)構(gòu)，目前研究結(jié)果可以分為四大類(lèi)：黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、皂苷類(lèi)、多糖類(lèi)[6-7]，而富含醌類(lèi)成分的中藥材則少有研究。一些研究結(jié)果表明，富含醌類(lèi)成分的中藥材中具有很強(qiáng)的α葡葡萄糖苷酶抑制活性[8，9]，但缺乏進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)篩選、分析、鑒定其潛在的活性小分子成分。因此，從富含醌類(lèi)的中藥材中篩選α葡葡萄糖苷酶抑制劑，并對(duì)其進(jìn)行分析和結(jié)構(gòu)鑒定，可以為進(jìn)一步臨床藥物開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

超濾技術(shù)[10]主要是利用親和原理，將具有潛在活性的小分子化合物與受體混合，得到受體配體復(fù)合物和未結(jié)合的小分子，通過(guò)超濾薄膜將未結(jié)合的小分子濾除后，復(fù)合物可以用有機(jī)溶劑處理，將小分子配體釋放出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)活性化合物與非活性化合物的分離，并通過(guò)LCESIMSn對(duì)收集得到的活性小分子化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。該方法具有靈敏度高、分析快速和高通量的特點(diǎn)，特別適用于中藥等復(fù)雜體系中活性成分的篩選。

本研究以α葡葡萄糖苷酶為藥物靶點(diǎn)，選取了2種富含蒽醌類(lèi)成分的中藥材（虎杖、大黃），對(duì)其α葡葡萄糖苷酶抑制作用進(jìn)行了測(cè)定， 并首次采用超濾技術(shù)從中藥材虎杖和大黃提取物中篩選出與α葡葡萄糖苷酶相結(jié)合的活性小分子化合物， 并通過(guò)LCMSn對(duì)其進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定[11，12]。共篩選得到16種α葡葡萄糖苷酶抑制劑。

3.2虎杖提取物化學(xué)成分的超濾篩選和質(zhì)譜鑒定

當(dāng)中藥提取物與蛋白靶分子相互混合作用時(shí)，具有親和性的小分子配體與蛋白形成復(fù)合物，而無(wú)親和性的化合物仍呈現(xiàn)游離狀態(tài)。當(dāng)混合溶液通過(guò)超濾薄膜時(shí)，大分子蛋白和小分子蛋白復(fù)合物被膜擋在一側(cè)，處于游離狀態(tài)的小分子化合物則能夠透過(guò)超濾膜，待活性化合物與非活性化合物分離后，破壞小分子蛋白復(fù)合物，收集釋放的活性小分子配體，利用LCESIMSn對(duì)其進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)的鑒定[10]。當(dāng)提取物中的活性成分與α葡萄糖苷酶發(fā)生特異性結(jié)合后，α葡萄糖苷酶捕獲的小分子配體所對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度和峰面積均大于其空白對(duì)照。

References

1Holman R R， Paul S K， Bethel M A， Matthews D R， Neil H A W. New England J. Medicine， 2008， 359（15）： 1577-1589

2Gaede P， LundAndersen H， Parving H H， Pedersen O. New England J. Medicine， 2008， 358（6）： 580-591

3GU JinNing， NIU Jiu， PI ZiFeng， YUE Hao， WU SuiSheng， LIU ShuYing. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（3）： 371-376

4Nathan D M， Buse J B， Davidson M B， Ferrannini E， Holman R R， Sherwin R， Zinman B. Diabetes Care， 2009， 32（1）： 192-203

5Matsui T， Tanaka T， Tamura S， Toshima A， Tamaya K， Miyata Y， Tanaka K， Matsumoto K. J. Agric. Food Chem.， 2007， 55（1）： 99-105

6FENG ChengGen， CHEN Lin， LIU Xia. Chinese J. New Drugs.， 2005， 14（6）： 669-672

7de Melo E B， Gomes A D， Carvalho I. Tetrahedron， 2006， 62（44）： 10277-10302

8GAO XiaoPing， ZHANG WeiYu， ZOU WenJun， SU Zhi， JI YuanQiao， LIU ZhongRong. Natural Product Research and Development， 2003， 15（6）： 536-538

9SHEN ZhongMing， LI Ying， JIANG Hong， YIN JianWei， XU ZhaoLong. Chinese J. Biochemical Pharmaceutics， 2000， 21（2）： 69-70

10Zhou H， Li H L， Zheng Z， Song F R， Xing J P， Liu Z Q， Liu S Y. J. Liquid Chromatogr. Relate Technol.， 2012， 35（14）： 1-14

11XIE YuPing， TIAN Jing， GAO Peng， XU GuoWang， FEI Xu， WANG Yi. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（1）： 36-41

12PENG SiYuan， ZHANG Jie， TIAN MeiPing， WANG ZhanLin， SHEN HeQing. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（9）： 1588-1592

13DONG Jin， WANG Hong， WAN LeRen， DUAN YuShu， CHEN ShiZhong. Chinese Journal of Chromatography， 2009， 27（4）： 425-430

14Liang Z T， Sham T， Yang G Y， Yi L， Chen H B， Zhao Z Z. Anal. Bio. Chem.， 2013， 405（12）： 4199-4212

15Wei J， Ying F W， Ge R L， Shi H M， Jia C Q， Tu P F. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2007， 21（14）： 2351-2360

16Li G B， Chen X G ， Liu M C ， Hu Z D. Analyst， 1998， 123（7）： 1501-1505

17Wei J， Ge R L， Wei Q J， Bao T Y， Shi H M， Tu P F. J. Chromatogr. A， 2006， 1132（12）： 320-324

18LIU GuoQiang， DONG Jing， WANG Hong， WAN LeRen， DUAN YuShu， CHEN ShiZhong. Chem. J. Chinese Universities， 2009， 30（8）： 1566-1570

10Zhou H， Li H L， Zheng Z， Song F R， Xing J P， Liu Z Q， Liu S Y. J. Liquid Chromatogr. Relate Technol.， 2012， 35（14）： 1-14

11XIE YuPing， TIAN Jing， GAO Peng， XU GuoWang， FEI Xu， WANG Yi. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（1）： 36-41

12PENG SiYuan， ZHANG Jie， TIAN MeiPing， WANG ZhanLin， SHEN HeQing. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（9）： 1588-1592

13DONG Jin， WANG Hong， WAN LeRen， DUAN YuShu， CHEN ShiZhong. Chinese Journal of Chromatography， 2009， 27（4）： 425-430

14Liang Z T， Sham T， Yang G Y， Yi L， Chen H B， Zhao Z Z. Anal. Bio. Chem.， 2013， 405（12）： 4199-4212

15Wei J， Ying F W， Ge R L， Shi H M， Jia C Q， Tu P F. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2007， 21（14）： 2351-2360

16Li G B， Chen X G ， Liu M C ， Hu Z D. Analyst， 1998， 123（7）： 1501-1505

17Wei J， Ge R L， Wei Q J， Bao T Y， Shi H M， Tu P F. J. Chromatogr. A， 2006， 1132（12）： 320-324

18LIU GuoQiang， DONG Jing， WANG Hong， WAN LeRen， DUAN YuShu， CHEN ShiZhong. Chem. J. Chinese Universities， 2009， 30（8）： 1566-1570

10Zhou H， Li H L， Zheng Z， Song F R， Xing J P， Liu Z Q， Liu S Y. J. Liquid Chromatogr. Relate Technol.， 2012， 35（14）： 1-14

11XIE YuPing， TIAN Jing， GAO Peng， XU GuoWang， FEI Xu， WANG Yi. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（1）： 36-41

12PENG SiYuan， ZHANG Jie， TIAN MeiPing， WANG ZhanLin， SHEN HeQing. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（9）： 1588-1592

13DONG Jin， WANG Hong， WAN LeRen， DUAN YuShu， CHEN ShiZhong. Chinese Journal of Chromatography， 2009， 27（4）： 425-430

14Liang Z T， Sham T， Yang G Y， Yi L， Chen H B， Zhao Z Z. Anal. Bio. Chem.， 2013， 405（12）： 4199-4212

15Wei J， Ying F W， Ge R L， Shi H M， Jia C Q， Tu P F. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2007， 21（14）： 2351-2360

16Li G B， Chen X G ， Liu M C ， Hu Z D. Analyst， 1998， 123（7）： 1501-1505

17Wei J， Ge R L， Wei Q J， Bao T Y， Shi H M， Tu P F. J. Chromatogr. A， 2006， 1132（12）： 320-324

18LIU GuoQiang， DONG Jing， WANG Hong， WAN LeRen， DUAN YuShu， CHEN ShiZhong. Chem. J. Chinese Universities， 2009， 30（8）： 1566-1570