方彩云　張曉勤　陸豪杰

摘要：棕櫚酰化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后脂質(zhì)修飾的重要形式之一，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝、凋亡、疾病的發(fā)生、發(fā)展等過程中都起著重要的作用。因此，定性和定量分析蛋白質(zhì)棕櫚酰化修飾對(duì)理解其生物學(xué)功能具有重要意義。本文綜述了近年出現(xiàn)的蛋白質(zhì)棕櫚酰化修飾分析技術(shù)和方法及其優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)其未來的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：棕櫚酰化修飾； 質(zhì)譜技術(shù)； 蛋白質(zhì)組學(xué)； 評(píng)述

1引言

蛋白質(zhì)翻譯后修飾的發(fā)生使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、功能更完善，在生物體內(nèi)起著極為重要的作用，脂類修飾便是其中一種非常重要的翻譯后修飾形式。棕櫚酸鹽是豐度最高的脂肪酸，可被共價(jià)修飾到蛋白質(zhì)上。根據(jù)連接方式不同，棕櫚?；揎椏煞譃镹型（通過酰胺鍵連接到Gly/Cys殘基上）和S型。蛋白質(zhì)的S型棕櫚酰化修飾（Palmitoylation）是指飽和的16個(gè)碳的棕櫚酸鹽通過硫酯鍵共價(jià)修飾到蛋白質(zhì)Cys的巰基上[1]，如圖1所示），它是一種動(dòng)態(tài)、可逆的翻譯后修飾形式，可在時(shí)間和空間上調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能。許多棕櫚?；揎椀目扇芑蛘夏さ鞍踪|(zhì)，如信號(hào)蛋白質(zhì)（包括在癌癥和突觸信號(hào)中斷關(guān)鍵因子）、細(xì)胞黏附分子和神經(jīng)遞質(zhì)受體等，可調(diào)控蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性，蛋白蛋白相互作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)定位膜脂筏等，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝、凋亡、疾病的發(fā)生和癌變中都起著重要的作用[1，2]。

深入研究和理解蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀臋C(jī)制，定性和定量分析含這種修飾的蛋白質(zhì)，以及對(duì)棕櫚?；腿プ貦磅；揎椣嚓P(guān)酶的理解、動(dòng)態(tài)監(jiān)控棕櫚酰化和去棕櫚?；闹芷冢瑢?duì)理解復(fù)雜信號(hào)通路的空間和時(shí)間調(diào)節(jié)等都具有重要意義。定點(diǎn)突變法是傳統(tǒng)的方法。一般是將候選的半胱氨酸Cys殘基突變?yōu)镾er或Ala，將突變體克隆和野生型分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并比較兩者的功能差異。但這種方法不能直接檢測內(nèi)源蛋白質(zhì)，棕櫚?；揎椢稽c(diǎn)的突變可能會(huì)導(dǎo)致附近的Cys殘基發(fā)生異常[3]。此外，許多蛋白質(zhì)棕櫚?；种苿┘叭プ貦磅；淖貦磅Ａ蛑敢脖粡V泛使用，例如，2溴軟脂酸乙烯（2Bromopalmitate， 2BP）[4]，淺藍(lán)菌素（Cerulenin）和衣霉素（Tunicamycin）等都具有較好的效果[5]。盡管這些方法的應(yīng)用促進(jìn)了人們對(duì)蛋白質(zhì)棕酰化修飾的認(rèn)識(shí)，但在沒有任何修飾位點(diǎn)信息提示的情況下，這樣的研究過程不但耗時(shí)費(fèi)力，而且棕櫚?；揎椢稽c(diǎn)的鑒定比較困難。這是因?yàn)椋海?）雖然已知一些蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶在富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域中有保守的DHHC motif，且也已發(fā)現(xiàn)幾種去?；?，但蛋白質(zhì)發(fā)生S棕櫚?；揎椇腿プ貦磅；揎椀拿笇W(xué)尚不清楚[6]；（2）還沒有明確的蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀墓沧R(shí)基序（Consensus motif）[7]；（3）棕櫚?；揎椡ǔ０l(fā)生在跨膜蛋白或膜相關(guān)的蛋白質(zhì)[8]，而膜蛋白的溶解度和豐度低，長鏈脂肪酸的加入更進(jìn)一步增加了其疏水性，增加了檢測難度；（4）不像磷酸化和糖基化修飾，它沒有親和基團(tuán)如棕櫚?；揎椞禺惖目贵w等用于富集低豐度的棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)。因此，人們對(duì)它的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)不及糖基化、磷酸化等其它翻譯后修飾。

目前，隨著質(zhì)譜和組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)及其修飾位點(diǎn)得到了鑒定，極大地促進(jìn)了人們對(duì)蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀睦斫?。為此，本文就基于質(zhì)譜和組學(xué)手段的棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)/肽段的分析方法及其進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

2生物信息學(xué)預(yù)測方法

3質(zhì)譜法直接檢測蛋白質(zhì)的棕櫚?；揎椢稽c(diǎn)和脂質(zhì)基團(tuán)

質(zhì)譜分析具有靈敏度高、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，能準(zhǔn)確分析連接到?；揎椀鞍踪|(zhì)甚至是單一?；揎椢稽c(diǎn)上的脂肪酸種類。一般是通過層析或免疫沉淀等方法獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)，根據(jù)序列的特性選擇合適的酶進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解后，然后比較羥胺處理前后相應(yīng)酶解肽段的質(zhì)量會(huì)發(fā)生變化，從而可通過質(zhì)譜方法鑒定該?；揎椈鶊F(tuán)的分子特性[14]。Hemagglutinin（HA）是一個(gè)主要的包膜糖蛋白調(diào)節(jié)病毒和細(xì)胞膜融合，通過含有一個(gè)跨膜域和一個(gè)胞質(zhì)尾的輕HA2鏈錨定在病毒包膜上，C末端區(qū)域的3個(gè)Cys殘基（一個(gè)在跨膜域，兩個(gè)在胞質(zhì)尾）是高度保守，且在所有HA亞型中都可能棕櫚?；ordyukova等[15]用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF MS）分析流感病毒蛋白HA上脂肪酸的類型時(shí)發(fā)現(xiàn)，具有兩個(gè)胞質(zhì)Cys的Influenza B virus HA含有棕櫚?；揎?，具有一個(gè)跨膜Cys的Influenza C virus HA發(fā)生了硬脂酸?；揎?，而有一個(gè)跨膜和兩個(gè)胞質(zhì)Cys的Influenza A virus HA則同時(shí)包含棕櫚酸鹽和硬脂酸?；揎?。Serebryakova等[16]用MALDITOF MS分析A/X31（H3 subtype），A/Puerto Rico/8/34 （H1 subtype）和A/FPV/Weybridge/34 （H7 subtype）病毒中C末端HA2肽段時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些肽段不僅能被棕櫚酸鹽修飾，還能被硬脂酸修飾，且3株病毒中棕櫚酸/硬脂酸的比例不同，其中A/FPV/Weybridge/34病毒株優(yōu)先結(jié)合硬脂酸。Ozols等[17]用溴化氰裂解、Trysin和LysC酶解純化的含[3H]palmitate標(biāo)記的αTubulin后進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，與C20， C213和C305相比，C376是主要的棕櫚酰化修飾位點(diǎn)。Bizzozero等[18]發(fā)現(xiàn)棕櫚酰化是天然髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白（PLP）的主要翻譯后修飾類型，且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大多數(shù)的PLP和DM20是完全?；?。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）被廣泛用于復(fù)雜組分的分離與鑒定，其具有GC的高分辨率和MS的高靈敏度，適于低分子化合物尤其是揮發(fā)性成分的分析。Sorek等用GCMS分析了蛋白質(zhì)AtROP6[19]和CBL1[20]上的脂質(zhì)基團(tuán)；在氧化鉑（Ⅳ）存在下，通過氫化反應(yīng)將S棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)的巰酯鍵打斷，釋放蛋白質(zhì)上的脂肪酸基團(tuán)并用純甲酸和乙醇產(chǎn)生乙基酯化后，用GCMS分析了蛋白質(zhì)的S棕櫚?；揎?，該法能分析低至1 μg的純化蛋白質(zhì)，并可實(shí)現(xiàn)S棕櫚?；降南鄬?duì)定量[21]，他們認(rèn)為，通過氫化反應(yīng)并結(jié)合乙基酯化可得到極性基團(tuán)的脂肪酸，提高GC的分離和鑒定。體外轉(zhuǎn)移甲基和穩(wěn)定同位素標(biāo)記法（iFAT）結(jié)合GCMS方法可定量比較不同細(xì)胞狀態(tài)下的?；揎梉22]，iFAT法適于處理疏水性的膜蛋白質(zhì)，通過數(shù)據(jù)庫檢索和標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲酯的色譜保留時(shí)間可實(shí)現(xiàn)?；蔫b定，穩(wěn)定同位素標(biāo)記可用作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)確比較不同細(xì)胞狀態(tài)下?；揎棥?

但許多棕櫚?；揎椀牡鞍踪|(zhì)是膜蛋白，疏水性較強(qiáng)，不容易得到純化的蛋白質(zhì)樣品，這在一定程度上限制該方法的應(yīng)用。

4以“棕櫚酸鹽為中心”的分析方法

4.1放射性棕櫚酸鹽代謝標(biāo)記法

最經(jīng)典的方法是用放射性棕櫚酸鹽（例如，3Hpalmitate和125Ipalmitate）代謝標(biāo)記培養(yǎng)細(xì)胞，通過放射自顯影檢測同位素標(biāo)記的程度，檢測棕櫚?；揎椀牡鞍踪|(zhì)，其中，3Hpalmitate是使用最廣泛的放射性標(biāo)記棕櫚酸鹽[23]。但該法操作繁瑣、需很長的曝光時(shí)間；使用較高濃度的放射性同位素，有害且處理費(fèi)用高；只能用于檢測活細(xì)胞中的棕櫚酰化修飾蛋白質(zhì)；產(chǎn)生的信號(hào)弱，靈敏度不高，不能檢測豐度較低的棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)；無法提供棕櫚酰化修飾的化學(xué)計(jì)量信息，且缺乏直接富集和鑒定放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法。

4.2棕櫚酸脂類似物代謝標(biāo)記法

疊氮或炔基脂肪酸探針非常靈敏，為快速檢測和富集細(xì)胞脂質(zhì)修飾蛋白質(zhì)提供了機(jī)會(huì)。由于含疊氮或炔基的棕櫚酸類似物從結(jié)構(gòu)和功能上來說都與它們的天然產(chǎn)物相似，因此能通過代謝通路進(jìn)入到細(xì)胞蛋白質(zhì)中。將含疊氮或炔基的棕櫚酸類似物代謝進(jìn)入細(xì)胞蛋白質(zhì)，然后通過化學(xué)選擇性鏈接如施陶丁格連接[24]或點(diǎn)擊化學(xué)[25]方法，選擇性地將帶疊氮或炔基基團(tuán)的蛋白質(zhì)連接到生物素或熒光基團(tuán)上，從而富集或檢測棕櫚?；揎椀牡鞍踪|(zhì)。與放射性棕櫚酸鹽代謝標(biāo)記方法相比，該法不使用放射性同位素，檢測時(shí)間較短，熒光基團(tuán)的使用大大提高了方法的靈敏度，可通過親和純化富集或利用熒光探針觀察棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)。

4.2.2以炔基為化學(xué)報(bào)告基團(tuán)的方法雖然疊氮基脂肪酸類似物在檢測蛋白質(zhì)脂肪酸?；揎椃矫嫒〉昧撕艽蟮倪M(jìn)展，但添加一個(gè)疊氮基團(tuán)到脂肪酸鏈上，可能會(huì)干擾脂肪酸的疏水性及其進(jìn)入脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的機(jī)制。而炔基可保留脂肪酸碳鏈的疏水性，減少脂肪酸物理化學(xué)性質(zhì)的變化及其與脂質(zhì)間的相互作用，且具有代謝惰性（圖2）。另外，通過點(diǎn)擊化學(xué)捕獲比施陶丁格連接的效率要高，因此炔基探針通常要優(yōu)于疊氮修飾的探針，具有更高的靈敏度和檢測效率[30]。利用基團(tuán)熒光檢測方法可提供研究動(dòng)態(tài)復(fù)雜的生物過程的手段[31]，定量熒光顯微鏡方法能用來研究活細(xì)胞內(nèi)GFPtagged棕櫚?；鞍踪|(zhì)的胞內(nèi)定位和運(yùn)輸[32，33]。因此，Hannoush等[34]將一系列不同碳鏈長度的ω炔基脂肪酸加到哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中，通過加成反應(yīng)將目標(biāo)蛋白質(zhì)連接到帶疊氮基團(tuán)的生物素或熒光基團(tuán)上，然后利用鏈霉親和素連接的辣根過氧化物酶進(jìn)行免疫印跡分析，并通過高分辨的共聚焦顯微鏡分析了含ω炔基脂肪酸蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞分布以及脂質(zhì)修飾蛋白質(zhì)在細(xì)胞分化不同階段的分布情況。Zhang等[35]利用串聯(lián)標(biāo)記和檢測的方法同時(shí)監(jiān)控動(dòng)態(tài)的S棕櫚酰化修飾和蛋白質(zhì)的更新，他們同時(shí)用兩種不同的化學(xué)報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行代謝標(biāo)記，一種用于檢測動(dòng)態(tài)的S棕櫚?；揎?，另一個(gè)則用來監(jiān)控蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)率，隨后用正交熒光標(biāo)簽依次地進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，從而有效地分析細(xì)胞中棕櫚酸鹽的循環(huán)周期。他們也發(fā)現(xiàn)，較短的脂肪酸類似物（az12和alk12）優(yōu)先標(biāo)記Nmyristoylated蛋白質(zhì)， 而較長的脂肪酸衍生物（az15和alk16））則會(huì)進(jìn)入S棕櫚?；揎椀牡鞍踪|(zhì)中[36]。Yount等[37]用alk16[38]為化學(xué)報(bào)告基團(tuán)，分析了鼠樹突狀細(xì)胞系中棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)組，共鑒定到157個(gè)具有不同細(xì)胞功能的脂質(zhì)修飾蛋白質(zhì)（其中60個(gè)和97個(gè)被分別為高可信度和中可信度），他們的研究發(fā)現(xiàn)，IFITM3的抗病毒活性受到S棕櫚?；揎椀恼{(diào)控。Yap等[39]將ω炔基棕櫚酸鹽類似物代謝進(jìn)入GAPDH或線粒體3羥基3甲基戊二?；鵆oA合成酶，通過點(diǎn)擊化學(xué)與疊氮的生物素探針或熒光探針3azido7hydroxycoumarin反應(yīng)快速檢測棕櫚?；揎?。Martin等[40]用商品化的17Octadecynoic acid （17ODYA）作為生物正交、點(diǎn)擊化學(xué)探針進(jìn)行原位標(biāo)記，從永生的Jurkat T細(xì)胞中共鑒定了125個(gè)高可信度和大約200個(gè)中間可信度的棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)，包括G蛋白、受體和一些質(zhì)膜定位依賴于棕櫚酰化修飾的水解酶等。這是首個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞棕櫚?；鞍踪|(zhì)組的分析。隨后，又將17ODYA代謝標(biāo)記和SILAC（Stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture）法相結(jié)合，在小鼠T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞中定性和定量了400多個(gè)棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)，并用17ODYA代謝脈沖追蹤標(biāo)記方法分辨穩(wěn)定的和更新較快的棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)[41]。

綜上，雖然“以棕櫚酸鹽為中心”方法有其優(yōu)點(diǎn)，但也存在不足之處：需將放射性或化學(xué)修飾的棕櫚酸脂類似物代謝標(biāo)記到細(xì)胞內(nèi)，故不能分析組織樣品和體液，且較難用于癌細(xì)胞，因?yàn)榘┘?xì)胞中脂肪酸合成酶的過度表達(dá)和過度活躍會(huì)極大地降低外源性長鏈脂肪酸的攝入[42]；與相對(duì)穩(wěn)定的棕櫚酰化修飾蛋白質(zhì)相比，該法可能會(huì)更加偏向棕櫚酸鹽更新較快的蛋白質(zhì)；只能分析特定的S酰化修飾，若引入棕櫚酸脂類似物，則只能分析棕櫚?；揎?，不能分析其它更短、更長或不飽和脂肪酸修飾的蛋白質(zhì)；來自于天然脂肪酸和放射性標(biāo)記的脂肪酸類似物之間的結(jié)構(gòu)差異帶來的生理影響還不清楚，真核細(xì)胞中代謝途徑非常復(fù)雜，棕櫚酸脂類似物可能會(huì)以不同的代謝途徑進(jìn)入，導(dǎo)致無法預(yù)測的生物學(xué)效應(yīng)。

ABE法的優(yōu)點(diǎn)是不需代謝標(biāo)記，可分析細(xì)胞（包括癌細(xì)胞）、組織和體液樣品，盡管在檢測棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)方面有了很大的進(jìn)展，但也有如下的局限性：（1）假陽性率相對(duì)較高：該法是巰酯鍵特異的方法而不是S棕櫚?；揎椞禺惖姆椒?，外源性的羥胺水解敏感的巰酯鍵蛋白質(zhì)都可能被同時(shí)富集而造成假陽性。實(shí)際操作時(shí)，首先要確保蛋白質(zhì)中原先存在的自由巰基完全封閉，需嚴(yán)格控制自由巰基封閉試劑的種類、用量和孵育時(shí)間等；需控制反應(yīng)時(shí)間、羥胺的濃度和溶液的pH值，保證羥胺完全切除棕櫚?；揎椈鶊F(tuán)；去除棕櫚?；揎椈鶊F(tuán)后，應(yīng)完全標(biāo)記新產(chǎn)生的自由巰基；用鏈霉親和素磁珠富集時(shí)，也可能會(huì)將體內(nèi)生物素化修飾蛋白質(zhì)富集而造成固有背景，以上這些因素會(huì)導(dǎo)致近三分之一的鑒定蛋白質(zhì)為假陽性結(jié)果[8， 54]。與ABE方法相比，點(diǎn)擊化學(xué)具有明顯較低的假陽性率[55]。因此，為減少假陽性結(jié)果，一般需進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。（2）該法為間接檢測和純化方法，用該法得到的蛋白質(zhì)可能是棕櫚酸修飾的蛋白質(zhì)，也可能是對(duì)羥胺水解敏感的其它脂肪酸修飾的蛋白質(zhì)，若需準(zhǔn)確鑒定連接到蛋白質(zhì)上的脂質(zhì)類型，則需采用GCMS進(jìn)一步分析。

6展望

由于缺乏明確的蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椢稽c(diǎn)，極大地阻礙了棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)功能的研究。盡管近年來已受到越來越多的重視，并取得了較大的進(jìn)展，尤其是ABE法和棕櫚酸鹽類似物代謝標(biāo)記方法的發(fā)展，使越來越多的棕櫚?；揎椢稽c(diǎn)得到了鑒定，但目前關(guān)于棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)組研究的報(bào)道主要集中于位點(diǎn)的鑒定，即定性研究，且現(xiàn)有方法也都各有其不足之處，因此，仍需致力于棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)定性與定量分析，發(fā)展更有效及準(zhǔn)確特異的研究方法，比如，由于棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)為細(xì)胞膜蛋白或者是與膜相關(guān)的蛋白質(zhì)，疏水性強(qiáng)，因此可結(jié)合細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組學(xué)方法，增加膜蛋白的溶解性；現(xiàn)有分析方法操作步驟多，易造成樣品損失尤其是低豐度蛋白質(zhì)的損失，且鑒定結(jié)果的假陽性率高，因此可適當(dāng)簡化操作流程，選用合適的去垢劑，采用選擇性好、富集效率高的新型富集載體，甚至是選用能同時(shí)滿足富集和定量分析要求的富集材料，并建立相應(yīng)的分析方法；發(fā)展靈敏度高、選擇性好的熒光檢測試劑；發(fā)展一些代謝效率更高的脂肪酸類似物等，從而提高樣品分析的重復(fù)性、靈敏度和定量的準(zhǔn)確性，以獲得更多可靠的棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)及其位點(diǎn)的信息，甚至與活細(xì)胞成像等方法相結(jié)合，從而有助于進(jìn)一步揭示動(dòng)態(tài)S棕櫚?；揎椀纳镏匾院凸δ堋?/p>

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