王紅梅，張 震，張平平

(1.齊都醫(yī)院，山東 淄博255400;2.山東省藥學(xué)會，山東 濟(jì)南250101;3.山東萬杰醫(yī)學(xué)院，山東 淄博255213)

環(huán)磷酰胺(CTX)和異環(huán)磷酰胺(IFO)為目前臨床上常用的烷化劑類抗腫瘤藥物，直接破壞DNA結(jié)構(gòu)和功能，屬細(xì)胞周期非特異性藥物［1］。本研究采用奧美拉唑(OMZ)作為測定CYP2C19酶活性的指針，通過測定大鼠體外培養(yǎng)體系中5－羥基奧美拉唑(5－OHOMZ)與奧美拉唑德的濃度比值，反映CYP2C19 酶的活性［2，3］，研究 CTX、IFO 對 CYP2C19酶活性的影響，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 高效液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司):紫外分光光度計(jì)、SCL－10Avp中央控制器、LC－10ATvp高壓泵、SIL－10ADvp自動(dòng)進(jìn)樣器及CLASS－VP 5.0色譜數(shù)據(jù)工作站;乙腈(色譜純，天津市西華特種試劑廠，批號:20050818);NADPH(北京拜爾迪生物公司，批號:20060810);奧美拉唑(珠海威爾凱化工有限公司，批號:20060730);磷酸氫二鈉(天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，批號:20060803);磷酸二氫鈉(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號:20061031);5－羥基奧美拉唑(分析純，購自Sigma公司);非那西丁(中國生物制品檢定所，批號:100113－200302);二氯甲烷(分析純，南京中山集團(tuán)公司化工廠，批號:20060115);甲醇(色譜純，天津市化學(xué)試劑三廠，批號:20070125);環(huán)磷酰胺及異環(huán)磷酰胺(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為:100113－200302、100595－200501)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex C8柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);島津 Shim － pack C8預(yù)柱(4.6 mm ×10 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈 －0.02 mol·L－1磷酸(26∶74，V/V)，用前經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾并經(jīng)超聲脫氣;檢測波長為302 nm;流速:1.0 mL·min－1;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取奧美拉唑、5－羥基奧美拉唑?qū)φ掌?，分別制成1 000 mg·L－1、1 mg·L－1的儲備液，內(nèi)標(biāo)物非那西丁制成100 mg·L－1水溶液。

精密稱取磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉;分別制成0.1 mol·L－1、0.02 mol·L－1的磷酸鹽培養(yǎng)液及緩沖液。精密稱取 NADPH制成100 mmol·L－1的NADPH輔因子溶液。

1.2.3 CYP2C19酶體外培養(yǎng)體系以及活性測定初始的培養(yǎng)體系中包括大鼠肝微粒體蛋白混懸液50 μL(蛋白濃度為 0.5 mg，350 μmol·L－1奧美拉唑溶液 20 μL，藥物溶液 20 μL，50 mmol·L－1NADPH 溶液 20 μL，最后加入 0.1 mol·L－1的磷酸鹽培養(yǎng)液使其最終體積為1 mL。在渦旋振蕩器上混和30 s，在37℃的水浴搖床中反應(yīng)20 min后，加入2 mL冰冷的二氯甲烷及非那西丁內(nèi)標(biāo)20 μL，渦旋混勻30 s(沉淀蛋白，中止反應(yīng))，以12 000 rpm離心5 min后，取有機(jī)層1 mL，N2氣下吹干，加入50 μL流動(dòng)相溶解，渦旋混勻30 s，以12 000 rpm離心5 min后，吸取上清液20 μL進(jìn)樣分析，同時(shí)以不含肝微粒體的平行空白對照實(shí)驗(yàn)來消除奧美拉唑自身水解帶來的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 Excel 2007和 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果均用±s表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性 按選定的色譜條件測得的奧美拉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液和5－羥基奧美拉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白大鼠肝微粒體蛋白、大鼠肝微粒體蛋白樣品處理后的色譜見圖1、2、3。結(jié)果表明，在選定的色譜條件下，大鼠肝微粒體混懸液中的物質(zhì)不影響奧美拉唑及5－羥基奧美拉唑的測定，且奧美拉唑、5－羥基奧美拉唑和內(nèi)標(biāo)峰分離良好。樣品中5－羥基奧美拉唑、內(nèi)標(biāo)和奧美拉唑的保留時(shí)間分別為7.292、11.996、24.674 min。

圖1 奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑色譜圖

圖2 空白大鼠肝微粒體蛋白色譜圖

圖3 大鼠肝微粒體蛋白樣品處理后色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系 取試管分別加入20 μL奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑?qū)φ掌废盗袧舛热芤?，然后分別加入0.05 mL大鼠肝微粒體蛋白混懸液，最后加入0.1 mol·L－1的磷酸鹽培養(yǎng)液至1mL，使奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑在培養(yǎng)液中的最終濃度分別為:1、3、5、7、9、11、13、15 μmol·L－1和 0.1、0.5、1、2、3、4、5 μg·mL－1，從“加入冰冷的二氯甲烷2 mL”開始，按CYP2C19酶活性測定的處理方法進(jìn)行操作。分別以測得奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑與內(nèi)標(biāo)非那西丁的峰面積之比Y對濃度X(μg·mL－1)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算直線回歸方程，得奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。奧美拉唑:Y=0.054 4X+0.035 5，r=0.999;5 － 羥基奧美拉唑:Y=0.259 5X －0.052 3，r=0.996。

結(jié)果表明，在大鼠肝微粒體培養(yǎng)體系中奧美拉唑在1 ～15 μmol·L－1(0.35 ～5.18 μg·mL－1)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，5 －羥基奧美拉唑在0.1 ～5 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 最低檢測限和最低定量限 在上述色譜條件下，以引起3倍于噪聲的被測樣品的進(jìn)樣量為最低檢測限，奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑分別為15 ng·mL－1和10 ng·mL－1。當(dāng)信噪比S/N=10時(shí)獲得最低定量限，結(jié)果顯示，奧美拉唑的最低定量限為(0.034±0.01)μg·mL－1，5 － 羥基奧美拉唑的最低定量限為(0.025 ±0.01)μg·mL－1。

2.4 精密度考察 在大鼠肝微粒體培養(yǎng)體系中分別加入高、中、低3個(gè)不同濃度的奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑?qū)φ掌啡芤?，混合均勻，得到最終濃度分別為 1、7、15 μmol·L－1和 1、3、5 μg·mL－1三種不同濃度的奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑樣品，按上述“1.2.3”項(xiàng)下方法操作，取上清液 20 μL 進(jìn)樣，所測結(jié)果分別代入奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中計(jì)算濃度，每個(gè)濃度一天內(nèi)重復(fù)測5次，計(jì)算其日內(nèi)精密度;每個(gè)濃度每天測定一次，連續(xù)測定5 d，同樣測定結(jié)果分別代入奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中計(jì)算濃度，計(jì)算其日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑的日內(nèi)和日間精密度(±s，n=5)

表1 奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑的日內(nèi)和日間精密度(±s，n=5)

對照品 加入濃度(μg·mL －1)日內(nèi)精密度(μg·mL－1)RSD(%)日間精密度(μg·mL－1)RSD(%)奧美拉唑3.17 5－羥基奧美拉唑17.271 120.897 259.06 16.73 ±3.87 112.22 ±1.58 252.98 ±4.35 3.99 1.70 4.45 16.57 ±3.40 111.66 ±2.35 249.38 ±3.06 3.54 2.55 50 150 250 48.96 ±1.63 144.06 ±4.54 241.31 ±6.45 3.34 3.15 2.67 47.94 ±1.77 144.06 ±4.53 241.31 ±6.48 3.69 3.15 2.67

2.5 回收率試驗(yàn) 在大鼠肝微粒體培養(yǎng)體系中分別加入高、中、低3個(gè)不同濃度的奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑?qū)φ掌啡芤海旌暇鶆?，得到最終濃度分別為 1、7、15 μmol·L－1和 1、3、5 μg·mL－1三種不同濃度的奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑樣品，按上述“1.2.3”項(xiàng)下方法操作，取上清液 20 μL 進(jìn)樣，所測結(jié)果分別代入奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中計(jì)算濃度，以含藥樣品經(jīng)處理后測得的色譜峰面積與相應(yīng)濃度的對照品溶液直接進(jìn)樣測得的色譜峰面積比作為提取回收率，計(jì)算以上3個(gè)濃度水平的提取回收率，結(jié)果見表2。

2.6 環(huán)磷酰胺及異環(huán)磷酰胺對大鼠肝粒體CYP2C19酶活性的影響 結(jié)果見表3。

表2 奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑的提取回收率(±s，n=5)

表2 奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑的提取回收率(±s，n=5)

對照品 加入濃度(μg·mL－1) 提取回收率(%)RSD(%)奧美拉唑17.271 120.897 259.06 95.79 ±4.20 93.45 ±1.86 98.10 ±4.77 4.38 1.99 4.86 5－羥基奧美拉唑50 150 250 96.60 ±3.87 95.36 ±1.72 96.31 ±1.86 4.01 1.80 1.93

表3 環(huán)磷酰胺及異環(huán)磷酰胺對大鼠CYP2C19酶活性的影響(±s，n=5)

表3 環(huán)磷酰胺及異環(huán)磷酰胺對大鼠CYP2C19酶活性的影響(±s，n=5)

藥物 濃度(mg·L －1)P值 抑制率(%)5－OHOMZ/OMZ不加入環(huán)磷酰胺1.06 ±0.01加入環(huán)磷酰胺 10 1.20 ±0.04不加異環(huán)磷酰胺 0 1.04 ±0.03異環(huán)磷酰胺0 0.000 2 20.7 ±3.47 10 1.26 ±0.040.001 12.63 ±6.32

3 討論

從表3中可以看出，環(huán)磷酰胺與異環(huán)磷酰胺對CYP2C19酶有顯著抑制作用。腫瘤化療藥物通常具有較小的治療指數(shù)，在臨床化療中往往很難預(yù)測腫瘤對藥物的反應(yīng)和機(jī)體毒性，因此抗腫瘤藥物的應(yīng)用及療效就受到很大的限制，集中表現(xiàn)為抗腫瘤藥物在患者體內(nèi)的藥效和毒性方面存在顯著的個(gè)體差異［4］。藥物代謝酶在抗腫瘤藥物的代謝中起著重要作用，對抗腫瘤藥的藥效及毒性的易感性有重要影響［5，6］。故實(shí)現(xiàn)臨床給藥個(gè)體化意義重大。而大多數(shù)化療藥物通常按經(jīng)驗(yàn)給藥，很少實(shí)行劑量個(gè)體化給藥。腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物易產(chǎn)生耐藥性，其機(jī)制可能有多種［7～9］。腫瘤耐藥性的產(chǎn)生是多種分子機(jī)制共同作用的結(jié)果。事實(shí)上，藥物代謝酶滅活增加也是腫瘤耐藥的潛在重要機(jī)制［10］。因此研究抗腫瘤藥物的代謝性相互作用，也有利于了解抗腫瘤藥的耐藥性產(chǎn)生機(jī)制，為臨床合理應(yīng)用該類藥物，減少抗藥性的產(chǎn)生提供參考依據(jù)。

環(huán)磷酰胺與異環(huán)磷酰胺是臨床常用的氮芥類烷化劑抗腫瘤藥，主要用于大腸癌、乳腺癌、前列腺癌等實(shí)體瘤及再生障礙性貧血的治療［11］。現(xiàn)已研究證實(shí)，環(huán)磷酰胺與異環(huán)磷酰胺在體內(nèi)都主要經(jīng)肝細(xì)胞色素P450代謝，而且均主要通過羥化代謝生成相應(yīng)的代謝產(chǎn)物。環(huán)磷酰胺與異環(huán)磷酰胺主要經(jīng)CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19 及 CYP3A4 代謝［12～15］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺與異環(huán)磷酰胺不同程度地抑制CYP2C19酶的活性，環(huán)磷酰胺與異環(huán)磷酰胺的氧化代謝與奧美拉唑的氧化代謝有一定相關(guān)性，兩者同時(shí)應(yīng)用會對CYP2C19酶活性產(chǎn)生競爭抑制。故在臨床上環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺與經(jīng)CYP2C19酶代謝的藥物聯(lián)合時(shí)，應(yīng)注意代謝性相互作用對相關(guān)藥物療效的影響。這一研究結(jié)果對于環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺和相關(guān)藥物的用藥個(gè)體化具有重要的臨床意義。

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