吳露露，劉 洋，劉 琦，汪岱迪，宗衛(wèi)峰

(江蘇省食品藥品檢驗所，江蘇南京210008)

硼替佐米是第一個應用于臨床的蛋白酶體抑制劑，于2003年5月以商品名萬珂(Velcade)被美國食品和藥物管理局(FDA)最先批準用于臨床治療多發(fā)性骨髓瘤，在2008年6月被批準為一線治療藥物，多項臨床試驗顯示其對多發(fā)性骨髓瘤具有良好的療效［1］，同時可克服化療耐藥性［2］。作為新一代有效治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物，它通過全新的機制發(fā)揮其抗腫瘤作用，在惡性疾病的治療中顯示出廣泛的應用前景。

硼替佐米不溶于水，且高濃度的硼替佐米溶液對鱟試劑(TAL)與細菌內毒素的凝集反應有干擾作用，而注射級的硼替佐米需要進行細菌內毒素或熱原等安全性項目的控制，有關硼替佐米的細菌內毒素檢查的方法學一直未見有文獻報道。由于鱟試劑與內毒素的反應一般都要在水溶液中進行，只有樣品完全溶解才能確保內毒素不被樣品包裹而釋放，為了確保結果的準確及操作簡便可行，本文探索一種新的思路即將不溶于水的藥物硼替佐米按制劑工藝的比例加入一定濃度的助溶劑(甘露醇)溶液使藥物溶解，再用BET水稀釋建立了凝膠法細菌內毒素檢查并經方法學驗證，以完善其質量標準，為該產品采用凝膠法進行細菌內毒素檢查提供科學依據(jù)，并為水不溶性藥物建立細菌內毒素檢查法提供幫助。

1 實驗材料

硼替佐米(某企業(yè)提供，規(guī)格:原料，批號:2618－15－25、2618－24－25、2618－33－25);鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格:0.1 mL，批號:1209052，靈敏度:0.125 EU·mL－1;規(guī)格:0.1 mL，批號:1211081，靈敏度:0.06 EU·mL－1。湛江博康海洋生物有限公司，規(guī)格:0.1 mL，批號:1209140，靈敏度:0.125 EU·mL－1;規(guī)格:0.1 mL，批號:1207131，靈敏度:0.06 EU·mL－1);細菌內毒素工作標準品(中國藥品生物制品檢定所，規(guī)格:1 mL，批號:150601－201174，效價:160 EU/支);細菌內毒素檢查用水(BET水，中國藥品生物制品檢定所，規(guī)格:5 mL，批號:201208);10%的甘露醇溶液(某企業(yè)提供，規(guī)格:250 mL:50 g，批號:130107120，BET 水無菌配制)。

2 方法與結果［3，4］

2.1 供試品細菌內毒素限值的確定 硼替佐米臨床用量為1.3 mg·m－2，按公式:L=K/M 計算［M為1.3 mg·m－2×1.62 m2·(60 kg·h)－1，K 為 5 EU·(kg·h)－1］本品的細菌內毒素限值L=K/M=［5 EU·(kg·h)－1］/［1.3 mg·m－2×1.62 m2·(60 kg·h)－1］=142 EU·mg－1。由于注射用硼替佐米(制劑)推薦的細菌內毒素限值為應小于25 EU·mg－1?？紤]到臨床用藥的安全因素以及與本品制劑的細菌內毒素限值保持一致，所以也將硼替佐米(原料)的細菌內毒素限值定為應小于25 EU·mg－1。

2.2 鱟試劑靈敏度的復核 按照《中國藥典》2010年版(二部)附錄細菌內毒素檢查法的要求復核所用鱟試劑，結果均符合規(guī)定。

2.3 干擾預試驗 目前市售鱟試劑λ一般為0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU·mL－1，將硼替佐米分別用10%的甘露醇溶液溶解并用BET水稀釋成0.02、0.01、0.005、0.002 5 和 0.001 25 mg·mL－1，將此系列溶液記為NPC。同時在上述試驗液中加入細菌內毒素標準溶液，使每一濃度的試驗液中均含有2λ濃度的細菌內毒素，記此系列溶液為PPC。取靈敏度為0.125 EU·mL－1的兩個不同廠家的鱟試劑，分別與上述NPC和PPC進行反應，每一濃度重復兩管，并設陰性對照(NC)和陽性對照(PC)，結果見表1。

預干擾試驗結果顯示:硼替佐米在濃度為0.02及0.01 mg·mL－1時對湛江安度斯生物有限公司鱟試劑與細菌內毒素的反應有明顯干擾抑制作用，在濃度為0.02、0.01 和0.005 mg·mL－1濃度時，對湛江博康海洋生物有限公司鱟試劑與細菌內毒素的反應有明顯干擾抑制作用。對兩個廠家鱟試劑均無干擾的濃度為 0.002 5 mg·mL－1、0.001 25 mg·mL－1，因此，正式干擾試驗的濃度選擇為0.002 5 mg·mL－1。

2.4 正式干擾試驗 為了最終確認是否存在抑制因素的影響，取硼替佐米分別用10%的甘露醇溶液溶解并用BET水稀釋，使其最終干擾試驗濃度為0.002 5 mg·mL－1，進行以下正式干擾試驗。

取靈敏度為0.06 EU·mL－1的兩個廠家鱟試劑，按《中國藥典》2010年版(二部)附錄中的供試品干擾試驗項進行實驗，結果見表2。

表2 硼替佐米的正式干擾試驗

表2結果表明:Es在0.5～2.0 λ(包括0.5 λ 和2.0 λ)范圍之內，Et則在0.5 ～2.0 Es(包括0.5 Es和2.0 Es)范圍之內。供試品在0.002 5 mg·mL－1濃度下，對鱟試劑與細菌內毒素的反應均無明顯干擾抑制作用。

2.5 標準的制定及供試品細菌內毒素檢查 根據(jù)上述干擾試驗的結果，制定的硼替佐米的細菌內毒素檢查標準為:取本品細粉適量，加10%的甘露醇溶液溶解并稀釋制成含硼替佐米為 5 mg·mL－1溶液后，依法檢查［《中國藥典》2010年版(二部)附錄ⅪE)，每1 mg硼替佐米中內毒素含量應小于25 EU。

根據(jù)上述檢驗標準，按《中國藥典》2010年版(二部)附錄Ⅺ E細菌內毒素檢查法，取靈敏度為0.06 EU·mL－1的的兩個廠家鱟試劑，分別對3批供試品進行細菌內毒素檢查。并同時設立供試品陽性對照管(PPC)、NC管和PC管。

試驗時，每批供試品取鱟試劑8支，分別用0.1 mL BET水溶解，其中2支加入供試品溶液(NPC)，2支加入供試品陽性對照溶液(PPC)，2支加入陰性對照溶液(NC)，2支加入陽性對照溶液(PC)，各種藥液的加樣量均為0.1 mL，37℃孵育60 min后觀察結果，結果見表3。

表3 硼替佐米的細菌內毒素檢查結果

3批硼替佐米的細菌內毒素檢查表明，供試品經兩個廠家的鱟試劑檢驗，結果均為符合規(guī)定。

3 討論

因鱟試劑與內毒素的反應需在水溶液體系中進行，因此凝結法細菌內毒素檢查會不同程度受到水不溶性藥物或物質本身或提取方法及提取溶劑等因素的影響，從而干擾測定結果，國外除了采用標準化的方法，還研究了一些替代方法以確保結果的可靠準確［5，6］。國內對不溶于水的藥物或制劑常采用加水振蕩萃?。?］或加入有機溶劑溶解，但前者并未提供回收率的數(shù)據(jù)，后者常出現(xiàn)加有機溶劑溶解后再加水稀釋時樣品重新析出或有機溶劑破壞內毒素的現(xiàn)象。為了確保結果的準確及操作簡便可行，本文探索一種新的思路即將不溶于水藥物硼替佐米按制劑工藝加入一定濃度的助溶劑(甘露醇)溶液(硼替佐米－甘露醇之比為1∶10)使藥物溶解，再用BET水稀釋，制成均一的溶液進行干擾預試驗和干擾確證試驗，結果均符合規(guī)定。試驗使用兩個不同廠家的鱟試劑，對3批樣品分別進行了干擾試驗，結果表明，高濃度硼替佐米對鱟試劑與細菌內毒素的凝集反應有干擾作用，在濃度稀釋至0.002 5 mg·mL－1時即可排除干擾作用。綜上所述，筆者認為硼替佐米原料經甘露醇溶液助溶后，可以采用細菌內毒素檢查法進行質量控制。

［1］王凡，趙春亭.硼替佐米致周圍神經病變機制的研究進展［J］.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2013，7(6):2641－2643.

［2］王立琳，肖若芝.蛋白酶體抑制劑—硼替佐米的臨床治療研究進展［J］.國際內科學雜志，2008，35(11):657－661.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄99－102，附錄212－215.

［4］中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范(2010版)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:287.

［5］Smulders S，Kaiser JP，Zuin S，et al.Contamination of nanoparticles by endotoxin:evaluation of different test methods［J］.Part Fibre Toxicol，2012，9:41

［6］Spaan S，Heederik DJ，Thorne PS，et al.Optimization of airborne endotoxin exposure assessment:effects of filter type，transport conditions，extraction solutions，and storage of samples and extracts［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73(19):6134－6143.

［7］胡容融.注射用油細菌內毒素檢查方法的研究［J］.廣東藥學院學報，2002，18(2):99 －101.