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機(jī)械拉伸對兔角膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移的影響

2014-10-26 07:33:40劉成星李曉娜馮鵬飛安美文陳維毅
太原理工大學(xué)學(xué)報 2014年1期
關(guān)鍵詞:雙軸周期性單軸

劉成星,李曉娜,馮鵬飛,安美文,陳維毅

(太原理工大學(xué) 應(yīng)用力學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程研究所,太原 030024)

角膜是影響視覺的重要組織。由于眼壓的波動,人角膜在生理性情況下即發(fā)生周期性變形[1]。眼屈光手術(shù)使角膜受到了一定程度的機(jī)械損傷,也改變了角膜所處的力學(xué)環(huán)境[2]。角膜基質(zhì)細(xì)胞受損后首先發(fā)生凋亡,隨后角膜基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生增殖和遷移,并轉(zhuǎn)化成角膜成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞,對受損角膜進(jìn)行損傷修復(fù)[3]。研究表明,一些細(xì)胞因子如EGF和bFGF在角膜細(xì)胞的增殖和遷移過程中發(fā)揮了重要作用[4-5];機(jī)械牽拉能夠影響細(xì)胞的增殖[6-7]和遷移[8-9]。而有關(guān)力學(xué)刺激對角膜細(xì)胞的增殖遷移影響尚未見報道。本文通過對兔角膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行周期性機(jī)械拉伸,探討力學(xué)刺激在角膜成纖維細(xì)胞增殖及遷移中的作用。

1 材料和方法

1.1 兔角膜成纖維細(xì)胞的原代提取、培養(yǎng)

本研究采用酶消化法獲取原代兔角膜成纖維細(xì)胞[10]。首先機(jī)械剝離上皮層和內(nèi)皮層,然后用2 mg/mL的Ⅱ型膠原酶消化組織塊,直至培養(yǎng)液完全清亮,離心后獲得角膜成纖維細(xì)胞,加入胎牛血清(Fetal bovine serum,F(xiàn)BS)體積分?jǐn)?shù)為10%的F12培養(yǎng)基,置于37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)使用2~5代細(xì)胞。

1.2 周期性力學(xué)加載

采用Flexcell4000柔性基底拉伸系統(tǒng)(美國Flexcell)對細(xì)胞實(shí)施周期性機(jī)械拉伸。將角膜成纖維細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化,以3×105的密度接種于裱襯有I型膠原蛋白的BioFlex@六孔培養(yǎng)板(美國Flexcell)上,置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞80%融合時,進(jìn)行5%拉伸應(yīng)變、0.1Hz正弦波的力學(xué)加載,卸載后進(jìn)行細(xì)胞周期檢測和劃痕實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞周期檢測

用胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為10%的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。卸載后12,24,36h收集細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)4℃預(yù)冷、體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇固定,采用細(xì)胞周期檢測試劑盒(南京凱基)通過流式細(xì)胞儀(德國Beckman)對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測,用S期(Synthesis phase,DNA合成期)占整個細(xì)胞周期的百分比表示細(xì)胞增殖情況。S期所占百分比越高,說明細(xì)胞增殖越旺盛。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

如圖1所示,接種細(xì)胞前,在培養(yǎng)皿底壁外側(cè)用標(biāo)記筆劃十字線。在Flexcell4000加載時,12.7 mm半徑之內(nèi)(圖1白色區(qū)域)細(xì)胞主要受等雙軸拉伸;半徑12.7~17.8mm范圍內(nèi)(圖1淺灰色環(huán)形區(qū)域),細(xì)胞主要受單軸拉伸[11]。加載前用10μL槍頭在等雙軸拉伸區(qū)域沿與標(biāo)記線垂直方向劃痕,在單軸拉伸區(qū)域沿標(biāo)記線平行方向劃痕。所有劃痕均與力的方向垂直。圖1中短直線代表劃痕,箭頭代表牽張力的方向。

先用FBS體積分?jǐn)?shù)為2%的培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12h,使細(xì)胞周期同步化。劃痕后,用PBS清洗,去除死細(xì)胞,換成FBS體積分?jǐn)?shù)1%的F12培養(yǎng)基。然后添加1ng/mL重構(gòu)人表皮生長因子(rhEGF)或100ng/mL重構(gòu)人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(rhbFGF)(美國PeproTech),以FBS體積分?jǐn)?shù)1%組作為對照。分別于0,5,10,20h拍照,測量各時刻的劃痕面積,用不同時間點(diǎn)的劃痕面積除以初始(0h)劃痕面積,獲得與初始面積的百分比。由于所取劃痕長度相同,因此該比值即相對劃痕寬度。相對劃痕寬度越小,說明細(xì)胞遷移速度越快。每個區(qū)域做8個劃痕,取均值。

圖1 體外劃痕實(shí)驗(yàn)示意圖

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±S表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件中單因素方差分析方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,p<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 周期性機(jī)械拉伸對角膜成纖維細(xì)胞增殖的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,兔角膜成纖維細(xì)胞在12h相對分裂最旺盛,S期占整個細(xì)胞周期的41.17%;隨著培養(yǎng)時間的增加,S期占細(xì)胞周期的比例明顯降低,36h下降為19.99%(圖2-a)。與各自靜態(tài)對照組相比,5%拉伸使S期細(xì)胞比例均有所增高。拉伸12h,S期雖為靜態(tài)對照組的1.12倍,但無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05);拉伸24h和36h時,S期分別為靜態(tài)對照組的1.22和1.24倍,具有顯著差異(p<0.05)(圖2-b)。

圖2 體外周期性機(jī)械拉伸對角膜成纖維細(xì)胞增殖的影響

2.2 周期性機(jī)械拉伸對角膜成纖維細(xì)胞遷移的影響

首先我們研究了bFGF與EGF對細(xì)胞遷移的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:無論是拉伸組還是靜態(tài)對照組,相對劃痕寬度均隨時間增加而減?。▓D3至圖5),說明細(xì)胞在損傷后均表現(xiàn)出不同程度的遷移行為。在未拉伸培養(yǎng)條件下,5h時,與1%FBS對照組相比,施加bFGF或EGF對相對劃痕寬度無明顯影響(p>0.05);10h后bFGF或EGF對細(xì)胞遷移行為的影響逐漸顯現(xiàn),表現(xiàn)為其相對劃痕寬度明顯小于1%FBS對照組(p<0.05);拉伸條件下具有同樣趨勢(圖4)。說明bFGF和EFG對細(xì)胞遷移均具有促進(jìn)作用,EFG作用效果略優(yōu)于bFGF,但二者之間無顯著差別(p>0.05)。

其次,我們研究了拉伸對角膜成纖維細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果表明:實(shí)施5%的周期性拉伸5h,與各自靜態(tài)對照組相比,無論是等雙軸還是單軸拉伸,相對劃痕寬度均無明顯差異(p>0.05);10h時,等雙軸拉伸組相對劃痕寬度雖較各自靜態(tài)對照組有所增加,但二者無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05),而單軸拉伸組細(xì)胞遷移則明顯受到抑制,表現(xiàn)為相對劃痕寬度顯著大于靜態(tài)對照組(p<0.05);20h時,無論是等雙軸拉伸還是單軸拉伸,拉伸組相對劃痕寬度均明顯大于各自靜態(tài)對照組(p<0.05)。說明拉伸抑制了角膜成纖維細(xì)胞的遷移,且抑制效應(yīng)具有時間依賴性,拉伸時間越長,抑制效應(yīng)越明顯。單軸拉伸對細(xì)胞遷移的抑制效應(yīng)早于且強(qiáng)于等雙軸拉伸。

3 討論

角膜受損后,角膜基質(zhì)由于水腫而發(fā)生膨脹,在傷口邊緣的基質(zhì)細(xì)胞首先發(fā)生凋亡?;|(zhì)細(xì)胞在生長因子和細(xì)胞因子的作用下向傷口處遷移、增殖,并合成各種細(xì)胞外基質(zhì),對角膜進(jìn)行損傷修復(fù)。因此角膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移對角膜基質(zhì)損傷修復(fù)具有重要意義。

如前所述,角膜本身在眼壓的周期性波動下就受到周期性牽拉的作用,屈光手術(shù)由于對基質(zhì)進(jìn)行了切削則使角膜受到的拉應(yīng)力增大。但有關(guān)機(jī)械拉伸對角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移的影響目前尚未見報道。我們通過對兔角膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行周期性機(jī)械拉伸后發(fā)現(xiàn),低幅度的機(jī)械拉伸能夠促進(jìn)兔角膜成纖維細(xì)胞增殖,但抑制了細(xì)胞遷移行為;bFGF和EGF能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移行為,因此一定程度上減弱了由牽拉引起的細(xì)胞遷移抑制效應(yīng);拉伸方式對遷移行為有影響。

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道,機(jī)械應(yīng)力能夠影響細(xì)胞增殖[6-7]。本研究結(jié)果提示機(jī)械牽拉可以通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖來影響角膜成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為,這對損傷后角膜組織早期修復(fù)具有積極意義。如屈光手術(shù)后,少量的基質(zhì)切削造成組織損傷的同時使角膜拉應(yīng)力增大。在這種情況下,拉應(yīng)力通過促進(jìn)細(xì)胞增殖而有利于損傷后角膜組織的修復(fù),這種行為是生物體自我保護(hù)的體現(xiàn)。

圖5 單軸周期性拉伸對角膜成纖維細(xì)胞遷移的影響

角膜損傷后上皮細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子和生長因子(如bFGF),并刺激淚腺分泌EGF。角膜成纖維細(xì)胞也可以產(chǎn)生各種生長因子并表達(dá)相應(yīng)受體,其中包括bFGF和EGF及其受體。這些生長因子通過自分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)角膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移行為[12]。研究表明bFGF和EGF均可以促進(jìn)角膜成纖維細(xì)胞遷移,并具有劑量依賴性[4-5]。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)施加100ng/mL bFGF或1ng/mL EGF 10h后明顯促進(jìn)了兔角膜成纖維細(xì)胞的遷移。此外,bFGF及EGF還可以減弱由拉伸引起的細(xì)胞遷移抑制行為。如5%等雙軸拉伸20h,bFGF和EGF作用組相對劃痕寬度分別為(44.11±9.81)%和(51.66±5.31)%,與1%FBS靜態(tài)對照組的(46.24±3.91)%相當(dāng)。這說明細(xì)胞生長因子bFGF和EGF能夠使角膜成纖維細(xì)胞在受拉狀態(tài)下保持適宜的遷移速度,從而有利于角膜的損傷修復(fù)。

本研究結(jié)果表明,5%、0.1Hz的周期性機(jī)械拉伸能夠抑制角膜成纖維細(xì)胞的遷移行為。這與Savla U等[8,13-14]的結(jié)果一致。周期性牽拉引起的氣道上皮細(xì)胞遷移行為受抑與FAK-JIP3-JNK(FAK:Focal Adhesion Kinase,局部粘附斑;JIP3:JNK-interacting protein 3,JNK相互作用蛋白3;JNK:c-Jun N-terminal Kinase,c-jun氨基末端激酶)信號途徑有關(guān)[13-14]。而對牛動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞施加5%、1Hz的雙軸周期性牽拉24h,用Transwell小室檢測細(xì)胞的遷移情況則發(fā)現(xiàn),拉伸能夠促進(jìn)動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移,拉伸組遷移細(xì)胞數(shù)目是靜態(tài)對照組的1.83倍[9]。該研究結(jié)果與我們及U.Savla等的結(jié)論相反,這可能與細(xì)胞種類及體外檢測細(xì)胞遷移的方法有關(guān)。Transwell小室主要檢測細(xì)胞在三維基質(zhì)環(huán)境中的遷移行為,細(xì)胞遷移的快慢除與細(xì)胞本身運(yùn)動能力相關(guān)外,還與細(xì)胞分泌的降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白(如基質(zhì)金屬蛋白酶)量有關(guān)。而細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn),主要考察二維培養(yǎng)條件下細(xì)胞的運(yùn)動變形能力。

此外,研究還發(fā)現(xiàn)角膜成纖維細(xì)胞的遷移行為與力學(xué)載荷的作用方式有關(guān)。單軸拉伸對角膜成纖維細(xì)胞的遷移行為抑制效應(yīng)比等雙軸拉伸明顯。T.A.Hornberger等[15]發(fā)現(xiàn)等雙軸拉伸和單軸拉伸均可以使C2C12細(xì)胞的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)和蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)磷酸化水平增高,但僅等雙軸拉伸可以引起核糖體S6激酶(Ribosomal S6kinase,p70S6k)磷酸化,這提示細(xì)胞對不同方式力學(xué)刺激的信號響應(yīng)機(jī)制不同。

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