房耀維，王淑軍，劉 姝，呂明生，焦豫良，陳國強(qiáng)，潘建梅

(淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

抗生素的長期廣泛使用導(dǎo)致耐藥性病原細(xì)菌種類增加，甚至出現(xiàn)“超級細(xì)菌”，新的感染性疾病也不斷涌現(xiàn)，致使新型抗生素的開發(fā)迫在眉睫［1-2］。放線菌可以產(chǎn)生豐富的抗生素，約70%的抗生素由放線菌產(chǎn)生［3］。由于陸源放線菌已經(jīng)被長期篩選和研究，從陸源放線菌中發(fā)現(xiàn)新抗生素的幾率已逐步降低［4］。海洋占地球面積的70%，且環(huán)境獨(dú)特，不僅造就了海洋放線菌種類豐富多樣，而且可以產(chǎn)生比陸源放線菌結(jié)構(gòu)和活性更加豐富多樣的代謝產(chǎn)物，為新型抗生素的開發(fā)提供了豐富的資源［5］。近十幾年來，日本、美國、德國、英國等一些國家和國內(nèi)的研究者逐步把新型抗生素的篩選方向轉(zhuǎn)向海洋［6］。特別是2005年首個(gè)專性海洋放線菌屬鹽孢菌屬 (Salinospora sp.)的報(bào)道，帶來新一輪海洋放線菌抗生素的研究和開發(fā)高潮，該屬放線菌可以產(chǎn)生豐富的新型抗生素［7］。至2010年，各國研究者在海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的放線菌屬有50個(gè)，其中在海洋環(huán)境首次描述的新屬有12個(gè)，大部分新屬可以產(chǎn)生新型抗生素［8］。分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，通過構(gòu)建宏基因組文庫篩選新型抗生素可以避開微生物的分離過程，擴(kuò)大了抗生素篩選范圍。但是，目前環(huán)境大片段DNA的提取困難、宏基因在宿主細(xì)胞中不表達(dá)或表達(dá)量低、無法進(jìn)行高通量的活性物質(zhì)篩選等問題制約了宏基因組文庫的實(shí)用性［9-10］。通過化學(xué)修飾或全化學(xué)合成可以獲得新穎抗生素，但是合成過程復(fù)雜，且造成環(huán)境污染［11］?？梢?，對海洋放線菌進(jìn)行調(diào)查，篩選分泌抗生素放線菌菌株，仍然是一個(gè)重要的開發(fā)新型抗生素的途徑。本研究對我國地處亞熱帶的西沙群島海洋沉積物樣品的放線菌進(jìn)行分離，比較了不同培養(yǎng)基及樣品處理方式對菌株分離的影響，考察分離放線菌對海水的依賴性，并考察了放線菌的抗菌活性，為新型抗生素的發(fā)現(xiàn)和研究提供菌種來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 取樣于西沙群島海域的永興島(16°50'N，112°19'E)、石島(16°50'N，112°19'E)、七連嶼(16°50'N，112°20'E)、西沙州(16°59'N，112°13'E)和鴨公島(16°30'N，111°40'E)，每個(gè)島周圍取樣點(diǎn)20個(gè)，水深10～15 m，樣品置入無菌玻璃瓶，立即放于冰盒保存，并盡快送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)處理。

1.1.2 供試菌株 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus AS1.2465)、大腸埃希菌 (Escherichia coli AS1.487)、啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae AS2.114)、擴(kuò)展青霉 (Penicillium expansum AS3.3703)，來源于中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.3 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基見表1，pH均為7.2，1×105Pa滅菌30 min，降溫后分別添加放線菌酮、萘啶酮酸至終濃度分別為100和25 mg/L。發(fā)酵培養(yǎng)基為黃豆粉培養(yǎng)基;指示菌細(xì)菌用培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，真菌為PDA培養(yǎng)基［12］。

表1 海洋沉積物放線菌分離培養(yǎng)基Table 1 Media for isolation marine actinomycetes

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 樣品預(yù)處理具體方法見表2［17］。

表2 海洋沉積物樣品預(yù)處理方法Table 2 Sampling processing strategy for marine sediment

1.2.2 菌株的計(jì)數(shù)與分離 稱取每個(gè)島的20份海泥樣品5 g(濕重)，混勻，作為這個(gè)島的總樣品，進(jìn)行放線菌的分離。用不同方式對樣品預(yù)處理后，用滅菌海水梯度稀釋，選擇適當(dāng)稀釋度涂布不同培養(yǎng)基平板，每個(gè)稀釋度10個(gè)重復(fù)，用Parafilm封口膜密封瓊脂平板，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4～8周。觀察瓊脂平板，根據(jù)菌落特征和簡單染色后顯微鏡觀察對不同放線菌和細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分，菌落計(jì)數(shù)。隨機(jī)抽取3個(gè)重復(fù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。將分離菌株點(diǎn)種于M1平板，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4～8周，用玻璃紙法顯微鏡觀察放線菌的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲，用印片法顯微鏡觀察放線菌孢子絲，結(jié)合樣品的不同以及菌落的大小、色澤、形態(tài)、生長速度等差異，區(qū)分不同放線菌。如果在原培養(yǎng)基平板生長，但是點(diǎn)種到M1平板后菌株不生長，則記為不同種類，并用原平板點(diǎn)種，用上述同樣方法區(qū)分不同菌株。

1.2.3 放線菌生長的海水依賴性判斷 根據(jù)Jensen的方法判斷菌株生長的海水依賴性［13］。將能在M1平板上生長的菌株點(diǎn)種于M1平板，不能生長于M1平板的菌株點(diǎn)種于菌株相應(yīng)的篩選平板。28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)至肉眼可見菌落后，用接種環(huán)同時(shí)點(diǎn)種于用去離子水和海水配置的相應(yīng)平板各一個(gè)。28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)6周，觀察菌落生長情況。

1.2.4 菌株的鑒定 根據(jù)放線菌菌株不同培養(yǎng)基上氣絲有無、菌絲顏色、可溶性色素有無等形態(tài)培養(yǎng)特征初步歸類，從每個(gè)類群中選取代表菌株，根據(jù)于素亞等［1］報(bào)道的方法進(jìn)一步鑒定放線菌到屬。

1.2.5 發(fā)酵樣品制備 將純化后的單菌落接種至M1培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細(xì)胞壓積(packed cell volume，PCV)2%后，取0.2 mL接種于裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中發(fā)酵10 d，8000×g，離心10 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜后為待測樣品。

1.2.6 抗菌活性的測定 采用管碟法測定抑菌活性［18］。每個(gè)牛津杯中加入200 μL發(fā)酵樣品，采用含金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、啤酒酵母、擴(kuò)展青霉的指示平板，于指示菌適合的溫度培養(yǎng)后觀察，并用游標(biāo)卡尺測定其抑菌圈大小。所有試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用 SPSS 17.0(SPSS Inc，Chicago，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌菌株的鑒定

根據(jù)放線菌菌株的形態(tài)培養(yǎng)特征歸類后選取代表菌株93株，進(jìn)行菌株鑒定。表明93株放線菌屬于放線菌9個(gè)科，13個(gè)屬，分別為鏈霉菌科(Streptomycetaceae)鏈霉菌屬(Streptomyces);諾卡菌科(Nocardiaceae)諾卡氏菌屬(Nocardia);擬諾卡菌科(Nocardiopsaceae)擬諾卡菌屬(Nocardiopsis);微球菌科(Micrococcaceae)節(jié)桿菌屬(Arthrobacter);束絲放線菌科(Actinosynnemataceae)束絲放線菌屬(Alloactinosynnema);小單孢菌科(Micromonosporaceae)小單孢菌屬(Micromonospora)、疣孢菌屬(Verrucosispora)和鹽孢菌屬(Salinispora);假諾卡菌科(Pseudonocardiaceae)糖單孢菌屬(Saccharomonospora)和無枝菌酸菌屬(Amycolatopsis);高溫單孢菌科(Thermomonosporaceae)馬杜拉菌屬(Actinomadura);微球菌科(Micrococcaceae)微球菌屬(Micrococcus)。其中，鏈霉菌屬菌株最多，占總菌數(shù)的40%。姜怡等［3］對波羅的海放線菌多樣性進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬菌株占培養(yǎng)菌株的大多數(shù)，達(dá)到50%以上。取樣時(shí)間、地點(diǎn)及海水深度等條件對放線菌的種類影響較大［7-8］。

2.2 不同樣品預(yù)處理方法對放線菌分離的影響

對樣品進(jìn)行預(yù)處理的目的是在提高放線菌孢子萌發(fā)，或者在最小程度殺死或抑制樣品中放線菌生長的條件下，最大程度地殺死或抑制除放線菌以外其他微生物的生長，從而利于樣品中放線菌的分離。采用11種物理及化學(xué)方法對樣品進(jìn)行預(yù)處理，利用10種培養(yǎng)基對海泥樣品中的放線菌進(jìn)行分離，共獲得放線菌菌株383株。樣品預(yù)處理后分離得到的放線菌菌株及篩選得率見表3。樣品預(yù)處理方式對放線菌分離有較大影響。樣品不進(jìn)行預(yù)處理，細(xì)菌菌落較多，細(xì)菌生長較放線菌快，較快的覆蓋滿平板，造成放線菌難以分離。真菌有時(shí)亦能生長，較快即可布滿平板，影響放線菌分離。通過加熱、干燥、輻射、化學(xué)藥劑及冷凍等方式對樣品進(jìn)行預(yù)處理，都不同程度地降低了細(xì)菌的數(shù)量，利于放線菌的分離。通過H2和H3處理后，不但降低了細(xì)菌的數(shù)量，并使放線菌數(shù)量有所增加，分離效果較好。其原因可能是55～60℃加熱激發(fā)了放線菌孢子的萌發(fā)。常顯波等［15］也發(fā)現(xiàn)55℃加熱增加了海泥樣品放線菌的分離數(shù)量。王海雁等［19］研究表明干燥可以顯著降低海泥樣品中細(xì)菌的數(shù)量，利于放線菌的分離。不同處理方式的放線菌分離率不同，表明不同放線菌對不同處理方式的抵抗性不同，從而造成放線菌得率的差異［16］?？梢?，采用不同預(yù)處理方式對同一個(gè)樣品進(jìn)行預(yù)處理，可以提高放線菌分離得率。

表3 不同樣品預(yù)處理方式對放線菌分離的影響Table 3 The effect of sampling processing strategy on the isolation of marine actinomycetes

2.3 不同培養(yǎng)基對放線菌分離的影響

采用10種培養(yǎng)基對海泥樣品中的放線菌進(jìn)行分離，共分離獲得383株放線菌，其中專性海洋放線菌23株，表4顯示了不同培養(yǎng)基分離到的放線菌數(shù)量。不同培養(yǎng)基分離到的放線菌菌株數(shù)目和種類都有較大差異。其中，培養(yǎng)基M8分離獲得的放線菌菌株數(shù)量最多，其次為M7培養(yǎng)基。Ward等［20］用20種培養(yǎng)基分離Mariana海溝處底泥樣品中的放線菌，也發(fā)現(xiàn)棉籽糖和組氨酸培養(yǎng)基的分離效果最好。M3、M4和M5分離獲得的菌株數(shù)量較少。這表明海洋放線菌對營養(yǎng)物的要求有一定偏好性，根據(jù)海洋放線菌的營養(yǎng)需求偏好性設(shè)計(jì)培養(yǎng)基成分，有望提高海洋放線菌的分離效率和數(shù)量。不同培養(yǎng)基篩選獲得的海水依賴性放線菌的數(shù)量差異也較大。雖然培養(yǎng)基M3、M4和M5分離的放線菌菌株數(shù)量較少，但是其中海水依賴性放線菌即專性海洋放線菌的比例較高，M5 最高，達(dá)到25.76%。Jensen 研究組［16］利用培養(yǎng)基M1至M5篩選深海樣品放線菌，分離得到了高比例的專性海洋放線菌，其中M5和M10分離得到的專性海洋放線菌比率分別為48%和82%。分析其原因，Jensen研究組取海泥樣品的位置較深，海水越深受到陸地淡水及氣候等因素的影響越小，因此專性海洋放線菌的比率較離島嶼或陸地較近或海水較淺的海泥樣品高。

不同培養(yǎng)基分離到的放線菌種類不同，其中M10分離的放線菌的屬的數(shù)量最多，達(dá)到9個(gè)屬;M5分離的放線菌屬只有2個(gè)，為鹽孢菌屬和鏈霉菌屬;其他培養(yǎng)基分離到4～5個(gè)屬的放線菌。盡管M6到M9分離得到的菌株數(shù)量較大，分離放線菌同樣分布于4～5個(gè)屬。這可能是由于添加了不同碳源、金屬離子等營養(yǎng)物質(zhì)，使得偏好這些營養(yǎng)條件的放線菌快速生長;但是這些快速生長的放線菌可能會抑制不偏好這些營養(yǎng)物的放線菌，減少放線菌分離的種類。M10分離的放線菌的屬的數(shù)量最多，可能是由于NRS提取物能滿足大多數(shù)放線菌的營養(yǎng)需求，且沒有添加外源營養(yǎng)物質(zhì)，不會加大放線菌之間的拮抗作用，因此能分離得到更多種類的放線菌。

2005年，Jensen研究組首次報(bào)道了專性海洋放線菌—鹽孢菌屬(Salinispora sp.)。目前，已經(jīng)有超過12個(gè)屬的專性海洋放線菌被分離報(bào)道［3］。我國的研究者Tian等［21］從南中國海篩選獲得了專性海洋放線菌新種Streptomyces oceani。雖然專性放線菌的報(bào)道較晚，但是由于專性放線菌可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和生物活性豐富新穎的次級代謝產(chǎn)物，成為海洋微生物研究熱點(diǎn)的明星類群，也引領(lǐng)更多研究者進(jìn)行海洋專性微生物的研究。本研究分離的專性海洋放線菌分別屬于鹽孢菌屬和小單孢菌屬。

表4 不同培養(yǎng)基對放線菌分離的影響Table 4 The effect of media on the isolation of actinomycetes

2.4 分離菌株的抑菌活性

用管碟法測定383株放線菌的抗菌活性(圖1，表5)。對于所有分離菌株而言，抑菌活性以抗革蘭陽性菌Staphylococcus aureus為主，達(dá)到總菌數(shù)的 19.06%，抗 Saccharomyces cerevisiae和抗Penicillium expansum的較少;抗Escherichia coli最少，僅為4.96%。專性海洋放線菌中具有抑菌活性的菌株數(shù)量顯著高于非專性海洋放線菌。姜怡等［3］對波羅的海放線菌進(jìn)行了分離和抗菌活性篩選，抗Staphylococcus aureus的菌株為20%，抗真菌的為10%，抗 Escherichia coli的為2.5%。肖靜等［22］對紅樹林樣品中的放線菌進(jìn)行了分離和抗菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)對 Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Candidaalb icans和水稻紋枯病原菌Rhizoctonia solani的抑菌活性的比率分別為19%、1.2%、8%和15%。由此可見，樣品不同，樣品中的放線菌組成不同，拮抗不同類型微生物的放線菌比率不同。但是總體上抗革蘭陽性菌Staphylococcus aureus的比例較高，抗革蘭陰性菌Escherichia coli的最少。

表5 383株放線菌的抗菌活性Table 5 The antimicrobial activities of 383 actinomycetes

圖1 抗菌活性篩選代表圖片F(xiàn)ig.1 The representative photo of antimicrobial activity strains

在所有產(chǎn)抗菌物質(zhì)的菌株中，有16株菌株同時(shí)抗革蘭陽性與陰性細(xì)菌，有13株可同時(shí)抗革蘭陽性與陰性細(xì)菌和酵母，有9株可同時(shí)抗革蘭陽性與陰性細(xì)菌和霉菌，有6株可同時(shí)抗革蘭陽性與陰性細(xì)菌、酵母和霉菌，而這6株菌中有4株為專性海洋放線菌。6株放線菌對供試菌的抑菌直徑見表6，CMG091屬于鏈霉菌屬，CMS053為小單孢菌屬，CMS039為小單孢菌屬，CMQ131、CMZ005和CMZ023均為鹽孢菌屬。CMZ005和CMZ023的抑菌圈直徑較大。專性海洋放線菌多生長緩慢，在搶占營養(yǎng)物及生存空間方面較生長較快的其他微生物明顯處于劣勢，因此，這些微生物為了能在海洋環(huán)境中占有一席之地，更容易進(jìn)化合成廣譜抑菌物質(zhì)，抑制其他微生物的生長，從而搶占營養(yǎng)及生存空間［23］。

表6 6株抗菌活性菌株的抗菌效果Table 6 The antimicrobial activities of 6 actinomycetes

3 討論

利用10種培養(yǎng)基、11種樣品預(yù)處理方式對南中國海域西沙群島的海洋沉積物樣品中的放線菌進(jìn)行分離，獲得了包括23株專性海洋放線菌在內(nèi)的383株放線菌。選擇代表性菌株93株進(jìn)行鑒定，表明菌株隸屬于9個(gè)科，11個(gè)屬。以Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae和Penicillium expansum為指示菌考察分離放線菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)抗Staphylococcus aureus最多，抗Escherichia coli最少，專性海洋放線菌中有抑菌活性的菌株比率顯著高于其他菌株。并獲得包含4株專性海洋放線菌在內(nèi)的6株放線菌對4種供試菌都有抗性，可以作為抗菌物質(zhì)開發(fā)的菌株來源。對于具有抗菌活性的放線菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)的純化、結(jié)構(gòu)鑒定，以及合成基因簇信息等研究正在進(jìn)行中。

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