王雪蓮，葛安興，騰秀志

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001;2.遼寧電力中心醫(yī)院，遼寧 沈陽 110003)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是最常見的生殖道感染病毒，與尖銳濕疣、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌等疾病密切相關(guān)［1-2］。研究證實，MHC-I限制性、HPV特異性的CTL能夠識別、殺傷病毒感染細(xì)胞及病毒轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞，在HPV感染的清除、宮頸上皮內(nèi)瘤變的消退及HPV相關(guān)腫瘤的控制過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［3-4］。而MHC-II限制性、抗原特異性的CD4+T細(xì)胞通過將活化信號傳遞給專職的抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)［5］，在 CTL 的效應(yīng)階段提供CTL生長刺激信號［6］，進而啟動和維持免疫反應(yīng)。因為HPV感染只限于局部皮膚，無系統(tǒng)感染相，因而外周循環(huán)中HPV特異性T細(xì)胞的數(shù)量少。為了研究HPV感染人群的抗原特異性的免疫反應(yīng)，應(yīng)用HPV抗原體外刺激擴增CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞，獲得相應(yīng)的T細(xì)胞系。在科研過程及臨床的免疫治療過程中，經(jīng)常需要將分離的T細(xì)胞或獲得的T細(xì)胞系進行凍存。為了研究細(xì)胞凍存后HPV特異性的T細(xì)胞系細(xì)胞存活率及功能，應(yīng)用包含10%二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、90%小牛血清的凍存液凍存6個T細(xì)胞系細(xì)胞，液氮中凍存不同時間后復(fù)蘇，臺盼藍(trypan blue)染色法檢測復(fù)蘇后T細(xì)胞系細(xì)胞的存活率，ELISPOT檢測復(fù)蘇后T細(xì)胞系細(xì)胞的功能，以利于更好地鑒定建系的細(xì)胞系及其推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

二甲基亞砜、小牛血清、臺盼藍、RPMI-1640培養(yǎng)基購自Fisher公司;細(xì)胞凍存盒購自美國Thermo Scientific公司;植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)購自美國 Sigma公司;ELISPOT板購自美國Millipore公司;IFN-γ單克隆抗體和生物素標(biāo)記的 Anti-IFN-γ單克隆抗體購自瑞典Mabtech公司;抗生物素蛋白結(jié)合的生物素化辣根過氧化物酶購自Vector Laboratories公司;ELISPOT分析儀為美國Cell Technology公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 T細(xì)胞系細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇 前期實驗建立了6個HPV特異性T細(xì)胞系(5個CD4 T細(xì)胞系和1個CD8 T細(xì)胞系)［7-8］，6個 T細(xì)胞系建立后應(yīng)用臺盼藍染色，計數(shù)細(xì)胞，測定細(xì)胞活力。T細(xì)胞系細(xì)胞離心后重懸于預(yù)冷的小牛血清中，混勻后逐滴加入等體積的預(yù)冷液體(20%二甲基亞砜和80%小牛血清)，使其細(xì)胞濃度為5×107/mL。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的凍存管中，每管細(xì)胞數(shù)不超過5×107，將細(xì)胞凍存管置于凍存盒中，－70℃冰箱中過夜，次日將細(xì)胞凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存。復(fù)蘇時將細(xì)胞凍存管自液氮中取出后置于37℃水浴箱中，晃動凍存管，在接近全部溶解時，將細(xì)胞移至離心管，RPMI1640-10F洗滌2次后，用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，臺盼藍染色后計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，次日再次計數(shù)細(xì)胞后用于ELISPOT實驗。

細(xì)胞存活率=(解凍時細(xì)胞數(shù)或過夜培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)/凍存前細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.2 ELISPOT檢測復(fù)蘇的T細(xì)胞系細(xì)胞的功能 應(yīng)用ELISPOT方法，以T細(xì)胞多克隆刺激劑PHA為抗原，檢測復(fù)蘇后的6個T細(xì)胞系細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力，同時設(shè)置陰性對照。ELISPOT步驟參考文獻［9］。IFN-γ 單克隆抗體(5 μg/mL)包被ELISPOT板，4℃過夜。次日PBS洗4次。用含5%人血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(RP-5H;50 μL/孔)37 ℃封閉2 h。每孔加入100 μL T細(xì)胞系細(xì)胞(1 × 105/孔)，50 μL PHA(10 μmol/L)，陰性對照孔中加入RP-5H代替PHA。每一條件設(shè)3個平行孔。平板置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜。次日，PBS洗4次后，加入生物素標(biāo)記的Anti-IFN-γ 單克隆抗體(1 μg/mL)，37 ℃ 孵育 2 h。PBS洗4次后，加入抗生物素蛋白結(jié)合的生物素化辣根過氧化物酶，37℃孵育1 h。PBS洗4次后，加底物二氨基苯(diaminobenzene)顯色。去離子水終止顯色。ELISPOT分析儀計數(shù)斑點數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞計數(shù)

表1 細(xì)胞凍存前后、過夜培養(yǎng)后的細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞存活率Table 1 The number and recovery rate of T cell line cells before and after cryopreservation and after overnight incubation

6個T細(xì)胞系凍存不同時間(32～54個月)后復(fù)蘇，凍存前后及過夜培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量見表1，分別計算解凍時及過夜培養(yǎng)后的細(xì)胞存活率。6個T細(xì)胞系細(xì)胞液氮凍存解凍后細(xì)胞的存活率為24.7% ～93.5%，過夜培養(yǎng)后細(xì)胞的存活率為2.5% ～72.2%(表1)。CD8 T細(xì)胞系細(xì)胞的存活率高于CD4 T細(xì)胞系細(xì)胞(表1)。

2.2 復(fù)蘇后T細(xì)胞系細(xì)胞分泌IFN-γ的能力

ELISPOT結(jié)果顯示，6個復(fù)蘇后的T細(xì)胞系細(xì)胞在PHA誘導(dǎo)后能分泌IFN-γ(表2、圖1)。

表2 6個T細(xì)胞系細(xì)胞在ELISPOT實驗中形成的斑點數(shù)(3個復(fù)孔)Table 2 Spot forming units formed by 6 T cell line cells in ELISPOT

圖1 ELISPOT檢測經(jīng)PHA刺激復(fù)蘇后的T細(xì)胞系細(xì)胞Fig.1 PHA-simulated T cell line cells by ELISPOT

3 討論

在研究病原感染后機體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)及過繼性細(xì)胞免疫治療腫瘤過程中，經(jīng)常需要將獲得的淋巴細(xì)胞進行凍存。細(xì)胞凍存與解凍可對細(xì)胞造成傷害，影響細(xì)胞的狀態(tài)。但加入細(xì)胞保護劑，慢凍快復(fù)溫，調(diào)整凍存細(xì)胞濃度等可減少凍存解凍過程對細(xì)胞的損傷。彭賢貴等［10］檢測－80℃條件下不同細(xì)胞濃度外周血干細(xì)胞凍存效果，結(jié)果顯示干細(xì)胞凍存9個月后細(xì)胞回收率在80%以上。本研究中6個T細(xì)胞系細(xì)胞液氮凍存32～54個月，解凍后細(xì)胞的存活率為24.7% ～93.5%，與楊琳等報道的 37.5% ～79.2%相似［11］，但5個細(xì)胞系的存活率低于彭賢貴等報道的80%以上［10］。其原因可能是細(xì)胞種類、凍存條件及凍存時間等影響細(xì)胞的復(fù)蘇率。本實驗發(fā)現(xiàn)CD8 T細(xì)胞系細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后可保持高存活率(93.5%)，遠高于CD4 T細(xì)胞系細(xì)胞(24.7%～61.9%)，而在過夜培養(yǎng)后存活率差別更為明顯(2.5%～72.2%)。因為實驗僅包括一個CD8 T細(xì)胞系，在今后的實驗中計劃增加CD8 T細(xì)胞系樣本，以進一步證實在凍存后CD8 T細(xì)胞系細(xì)胞均較CD4 T細(xì)胞系細(xì)胞能夠保持好的存活率。6個T細(xì)胞系細(xì)胞解凍后細(xì)胞的存活率均高于過夜培養(yǎng)后的存活率，可能的原因是一部分T細(xì)胞盡管在解凍時處于活力狀態(tài)，但已經(jīng)進入到細(xì)胞死亡程序，經(jīng)過過夜培養(yǎng)后，此部分細(xì)胞死亡。

細(xì)胞凍存的質(zhì)量可通過復(fù)蘇后細(xì)胞的功能實驗驗證。楊琳等［11］應(yīng)用記憶性抗原 Pediacel及胰島特異性抗原GAD65刺激復(fù)蘇后的胰島抗原特異性T細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生的反應(yīng)較低。本研究中以多克隆刺激劑PHA為抗原，誘導(dǎo)復(fù)蘇后的T細(xì)胞分泌IFN-γ，結(jié)果顯示6個T細(xì)胞系細(xì)胞均能產(chǎn)生明顯的IFN-γ分泌。計劃以合成的HPV多肽為抗原，檢測復(fù)蘇的HPV特異性的T細(xì)胞系細(xì)胞是否能夠識別HPV抗原并分泌IFN-γ，以進一步明確細(xì)胞的凍存解凍過程對抗原特異性T細(xì)胞系細(xì)胞功能的影響。

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