夏大平，司 青，蘇現(xiàn)波，胥帥帥，馬俊強

(1.河南理工大學，河南焦作 454003;2.瓦斯地質(zhì)與瓦斯治理國家重點實驗室培育基地，河南 焦作 454003)

化石燃料的枯竭讓世界陷入能源危機，各國都在尋找一種可再生的清潔能源，其中煤制生物甲烷在美國粉河盆地和圣胡安盆地的成功開發(fā)利用使人們認識到生物氣對提高煤層含氣量及資源量具有重要意義，學者們對生物制甲烷也進行了較多的研究，證明了在適宜的實驗室條件下煤可以被微生物降解轉(zhuǎn)化成生物氣［1-12］。產(chǎn)甲烷菌株是煤制生物甲烷的核心，產(chǎn)甲烷菌的種類和數(shù)量不但是生物制甲烷最基礎的研究課題，也為其遺傳育種和生理生化的研究提供了重要的微生物資源［12-18］。為了解產(chǎn)甲烷菌在煤發(fā)酵產(chǎn)生生物氣方面的作用，探討生物成因煤層氣的形成機理及其影響因素，本研究以白腐真菌和礦井水中的厭氧菌群為菌種來源，對本源菌進行富集和鑒定，研究鶴壁煤和礦井水中本源微生物的生長繁殖特性，并采取EDTA二鈉處理重金屬含量較高的煤，以激活厭氧發(fā)酵體系中微生物的代謝活性，證明其作用［19-22］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 產(chǎn)氣基質(zhì) 以山西省華晉焦煤集團沙曲礦的焦煤和河南省鶴壁煤業(yè)集團中泰礦的瘦煤為產(chǎn)氣基質(zhì)。于回采工作面采集新鮮煤樣，帶回實驗室后用粉碎機粉碎，篩選出粒度為60～80目的煤粉;然后將煤粉放入高壓滅菌鍋內(nèi)121℃下滅菌30 min;最后將煤樣轉(zhuǎn)移至無菌的樣品袋中，并將樣品袋放入70℃的恒溫干燥箱中烘干至恒重，備用。

1.1.2 菌種 白腐真菌:由河南理工大學生物技術實驗室提供，將菌種接種到PDA固體斜面培養(yǎng)基上，并置于4℃冰箱保存;厭氧發(fā)酵菌群:所用的厭氧發(fā)酵菌群分別為取自沙曲礦和中泰礦業(yè)的礦井水，采用無菌的塑料桶在工作面排水溝中采集新鮮礦井水，待桶內(nèi)裝滿后迅速封閉，回到實驗室后置于4℃冰箱內(nèi)保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①白腐菌富集培養(yǎng)基;②產(chǎn)甲烷菌富集培養(yǎng)基:L11.0 g，S10.4 g，L24.0 g，J 1.0 g，L30.1 g，Y 1.0 g，L40.5 g，礦井水 1000 mL;③反硝化菌分離計數(shù)培養(yǎng)基:硝酸鉀1.0 g，乙酸鈉 1.0 g，磷酸二氫鉀 1.0 g，氯化亞鐵 0.05 g，氯化鈣 0.2 g，硫酸鎂 1.0 g，BTB 1.0 mL(1%，用酒精溶解)，瓊脂20.0 g，超純水 1 L，pH≈7.3。

1.1.4 實驗儀器 高壓滅菌鍋;多功能智能厭氧系統(tǒng);電熱恒溫培養(yǎng)箱;厭氧工作站;X射線衍射儀;氣相色譜儀;菌種鑒定所用主要儀器:倒置熒光顯微鏡，臺式高速離心機，此外，還有PCR儀、凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等;厭氧發(fā)酵實驗裝置(圖1):采用三角瓶和乳膠管為材料，利用排水集氣法收集發(fā)酵產(chǎn)生的氣體，并定期觀察排出的水量多少。

圖1 實驗裝置示意圖Fig.1 Experimental device

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)甲烷菌鑒定 利用種屬特異性PCR法快速鑒定礦井水中是否含有產(chǎn)甲烷菌。步驟如下:①產(chǎn)甲烷菌培養(yǎng):配制產(chǎn)甲烷菌富集培養(yǎng)基，于121℃高壓蒸汽鍋內(nèi)滅菌20 min，在厭氧狀態(tài)下將礦井水接種到培養(yǎng)皿中，每組礦井水接種到3～4個培養(yǎng)皿中作為平行樣，并用已滅過菌的涂布棒涂抹均勻。接種完畢后沖入氮氣。將厭氧罐放入35℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中10～20 d以擴增產(chǎn)甲烷菌;②礦井水中細菌總DNA提取:用少量的無菌超純水將培養(yǎng)基上的菌落沖洗至2 mL離心管中，通過分光光度計測量在600 nm波長下菌液的OD值，并用無菌超純水調(diào)節(jié)菌液的OD濃度值在1.0×109左右，使菌液濃度符合DNA提取試劑盒的要求;③PCR擴增:使用產(chǎn)甲烷菌16S rDNA特異性引物:Met 83F(5V-ACKGCTCAGTAACAC-3V)，Met 1340R(5V-CGGTGTGTGCAAGGAG-3V)擴增目的基因。PCR擴增體系如下:10×Taq 聚合酶反應緩沖液2.5 μL;dNTP(20 mmol/L)2.5 μL;5'端引物(25 pmol/μL)1 μL;3' 端引物(25 pmol/μL)1 μL;Mg2+(2.5 mmol/L)2 μL;DNA 模板 1 μL;Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL;dd H2O 14.8 μL;總體積 25 μL。反應條件:94℃預變性3 min;94℃變性30 s，58℃復性30 s，72℃延伸90 s，經(jīng)30個循環(huán)后，最后再72℃延伸10 min。擴增反應在PCR儀中進行。

1.2.2 反硝化菌分離計數(shù) 采用稀釋平板涂布法對礦井水中的反硝化菌進行計數(shù)。將接種好的培養(yǎng)基置于35℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3～4 d后，觀察培養(yǎng)基上藍色和具有藍色暈圈的單菌落，即為反硝化細菌。

1.2.3 以沙曲礦礦井水為菌種源的產(chǎn)甲烷實驗以沙曲礦的焦煤為發(fā)酵基底，以同礦區(qū)的礦井水和實驗室保存的白腐菌菌液為菌種來源，分別向培養(yǎng)基中添加不同濃度梯度的EDTA二鈉，研究煤樣在不同濃度梯度的EDTA二鈉下的產(chǎn)甲烷規(guī)律。

表1 沙曲礦礦井水為菌種源的產(chǎn)甲烷實驗Table 1 The methanogenic experiment by taking Shaqu mine water as strains source

1.2.4 以中泰礦業(yè)礦井水為菌種源的產(chǎn)甲烷實驗 以沙曲礦的焦煤為發(fā)酵基底，以鶴壁中泰礦業(yè)的礦井水和實驗室保存的白腐菌液為菌種來源，分別向產(chǎn)甲烷菌富集培養(yǎng)基中添加不同濃度梯度的EDTA二鈉，研究煤樣在不同梯度濃度EDTA二鈉下的產(chǎn)甲烷規(guī)律。發(fā)酵產(chǎn)甲烷實驗開始前，預先將煤樣進行滅菌，并用產(chǎn)甲烷菌富集培養(yǎng)基富集礦井水中的產(chǎn)甲烷菌6 d，實驗所用材料及其配比見表2。

表2 以鶴壁中泰礦業(yè)礦井水為菌種源的產(chǎn)甲烷實驗Table 2 Methanogenic experiment by taking mine water of China and Thailand mining in Hebi as strains source

1.2.5 分析項目與測試方法 ①產(chǎn)甲烷菌鑒定:為了檢驗礦井水中是否存在產(chǎn)甲烷菌，將PCR擴增產(chǎn)物與上述樣品緩沖液(loading buffer)混合后，在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，以DNA marker為對照。將電泳后的瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，觀察1200 bp處是否有明亮的DNA條帶出現(xiàn)，若有，說明該礦井水中含有產(chǎn)甲烷菌，否則為不含;②產(chǎn)氣量測定:采用排水集氣法收集發(fā)酵產(chǎn)生的氣體，通過測量排出水量的大小反映產(chǎn)氣量;③氣體組分及濃度測定:用氣相色譜儀檢驗發(fā)酵產(chǎn)生的氣體。TCD檢測器，5A柱，硅膠柱，進樣器50℃，檢測器100℃，熱絲150℃，載氣為Ar，手動進樣，進樣量為1 mL;④反硝化菌分離與計數(shù):由于反硝化菌在生長過程中會分泌出堿性物質(zhì)，故可采用BTB培養(yǎng)基利用稀釋平板計數(shù)法對反硝化菌進行計數(shù)并觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙曲礦礦井水為菌種源的產(chǎn)甲烷結(jié)果

于發(fā)酵后第40天測試各樣品發(fā)酵所產(chǎn)生的氣體組分及其濃度，具體結(jié)果見表3。

表3 產(chǎn)氣結(jié)果Table 3 The results of gas production

由表3可知，所有樣品均沒有產(chǎn)生CH4。分析認為，沙曲礦的礦井水中可能不存在產(chǎn)甲烷菌。采用種屬特異性PCR法快速鑒定沙曲礦礦井水中是否含有產(chǎn)甲烷菌，并以中泰礦業(yè)的礦井水樣品為對照，各樣品的DNA凝膠電泳結(jié)果見圖2。

圖2 PCR擴增結(jié)果Fig.2 The results of PCR amplification

由圖2可見，以鶴壁中泰礦業(yè)的礦井水為菌種來源時，在對礦井水細菌的DNA提取和PCR擴增后，凝膠電泳圖譜中在1200 bp處出現(xiàn)了產(chǎn)甲烷菌特有的DNA片段;而以沙曲礦的礦井水為菌種來源，未見有產(chǎn)甲烷菌應有的條帶。上述結(jié)果說明中泰礦業(yè)的礦井水中有產(chǎn)甲烷菌，而沙曲礦礦井水中不含有產(chǎn)甲烷菌，故在本次產(chǎn)甲烷實驗中所有樣品均未產(chǎn)出CH4是必然的。

由已知資料可知，沙曲礦礦井水pH為8.47，而中泰礦業(yè)礦井水的pH為7.19。因此，分析認為沙曲礦礦井水中不含產(chǎn)甲烷菌的原因主要是沙曲礦的水環(huán)境偏堿性，超出了產(chǎn)甲烷菌適宜的生長范圍。

同時，由表3可以看出，盡管所有樣品中均未有CH4產(chǎn)生，但是都產(chǎn)生了一部分的N2，尤其以A2號樣品產(chǎn)出的N2量最大，達到10.5 mL/g。分析認為，這主要是由于礦井水中的反硝化細菌在厭氧發(fā)酵過程中進行了反硝化作用，生成了大量N2。采用稀釋平板涂布法對沙曲礦礦井水中的反硝化進行計數(shù)，得出反硝化菌數(shù)目為1.75×103個/mL，各稀釋度礦井水中反硝化菌的菌落生長情況見圖3。

圖3 各稀釋度礦井水中反硝化菌的菌落生長情況Fig.3 The growth of denitrifying bacteria colony at different dilution

2.2 中泰礦業(yè)礦井水為菌種源的產(chǎn)甲烷結(jié)果

于發(fā)酵后第40天測試各樣品產(chǎn)生的氣體組分及濃度，結(jié)果見表4。

表4 產(chǎn)氣結(jié)果Table 4 The results of gas production

根據(jù)表4繪出，EDTA二鈉和CH4產(chǎn)率的關系見圖4。

圖4 EDTA二鈉濃度與CH4產(chǎn)率關系圖Fig.4 The relevance between edetate disodium concentration and methane production rate

由圖4可見，以中泰礦業(yè)的礦井水為菌種源時，所有的樣品中均有CH4產(chǎn)出，且CH4產(chǎn)率隨著EDTA二鈉濃度的增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。由表4可見，當EDTA二鈉用量為1.0 g/L時，CH4產(chǎn)率達到最大，為10.0 mL/g，是不加ED-TA二鈉時的3.8倍。可見，適量的EDTA二鈉可以顯著增加CH4產(chǎn)率。分析認為，EDTA二鈉的作用主要有以下兩點:一方面，EDTA二鈉可以和溶液中的重金屬離子絡合成穩(wěn)定的絡合物，阻止重金屬離子被厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的硫化物沉淀，避免產(chǎn)甲烷菌等微生物因溶液中重金屬離子濃度不足而代謝活性減慢;另一方面，煤中含有重金屬元素，會對產(chǎn)甲烷菌等微生物造成毒性抑制，EDTA二鈉可以絡合煤中的一部分重金屬，從而減輕了重金屬的抑制效應。由此可見，EDTA二鈉在溶液中具有維持重金屬離子平衡的功能，使重金屬離子的含量既不致于過低而影響微生物的生長代謝活性，又不致于過高而對微生物產(chǎn)生毒性抑制。此外，由圖4可見，當EDTA二鈉用量超過1.0 g/L時，CH4產(chǎn)率呈現(xiàn)出降低的趨勢，此時EDTA二鈉表現(xiàn)出一定地負面效應。這是因為溶液中過量的EDTA二鈉會與微生物細胞膜表面上的金屬離子結(jié)合，導致菌體死亡。

由表4可見，氣體組分中仍然有較高含量的N2，這也是反硝化菌的代謝結(jié)果。利用稀釋平板涂布法對中泰礦業(yè)礦井水中的反硝化菌進行分離計數(shù)，得出其中反硝化菌數(shù)目為8.50×102個/mL，遠低于沙曲礦的礦井水中反硝化菌的數(shù)目。

2.3 發(fā)酵前后發(fā)酵液的pH值分析

測試各樣品在發(fā)酵前后液體的 pH值，見表5。

表5 反應液pH變化情況表Table 5 The change of pH value in reactive fluid

由表5可見，所有樣品在發(fā)酵后其液體的pH值均顯著升高。分析認為，主要原因有以下3個方面:①反硝化菌和產(chǎn)甲烷菌等以發(fā)酵水解菌降解煤所產(chǎn)生的酸性物質(zhì)(如甲酸、乙酸、丙酸等)為碳源進行生長代謝，從而降低了溶液被酸化的程度;②產(chǎn)甲烷菌以發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CO2為碳源，通過CO2還原途徑產(chǎn)生CH4，吸收了一部分的CO2;③反硝化菌在進行反硝化的過程中分泌出大量堿性物質(zhì)，也使得溶液的pH值升高。

3 討論

分別以沙曲礦及中泰礦業(yè)礦井水為主要菌種來源，以沙曲礦的焦煤為發(fā)酵基底，從反硝化菌、重金屬元素的角度去研究生物甲烷形成的影響因素，得出以下結(jié)論:①沙曲礦礦井水中未檢測到產(chǎn)甲烷菌，一方面是由于礦井水的pH值較高，不適宜產(chǎn)甲烷菌生長，另一方面是因為礦井水中的反硝化菌含量較多，從多個角度抑制了產(chǎn)甲烷菌的存活;②反硝化菌會在厭氧發(fā)酵的過程中進行反硝化作用生成大量N2，使CH4濃度降低，且會消耗酸性代謝產(chǎn)物、分泌堿性物質(zhì)，使溶液的pH值升高;③EDTA二鈉可以維持溶液中重金屬離子濃度的平衡，使其含量既不會過低，又不會過高，因而可以顯著提高CH4產(chǎn)率，但是當EDTA二鈉濃度過高時，又會造成菌體死亡，降低產(chǎn)氣率。

［1］毛勝勇，蘇勇，楊翠鳳，等.仔豬結(jié)腸中產(chǎn)甲烷菌群多樣性及其與環(huán)境因子的相關性［J］.微生物學報，2011，51(10):1390-1397.

［2］夏大平，陳鑫，蘇現(xiàn)波，等.氧化還原電位對低煤階煤生物甲烷生成的影響［J］.天然氣工業(yè)，2012，32(11):107-110.

［3］李明宅，張搖輝.煤的厭氧降解產(chǎn)氣作用［J］.天然氣工業(yè)，1998，25(4):487-494.

［4］劉洪林，劉春涌，王紅巖，等.西北低階煤中生物成因煤層氣的成藏模擬實驗［J］.新疆地質(zhì)，2006，4(2):149-152.

［5］王愛寬，秦勇.褐煤本源菌在煤層生物氣生成中的微生學特征［J］.中國礦業(yè)大學學報，2011，40(6):888-893.

［6］王愛寬，秦勇.生物成因煤層氣實驗研究現(xiàn)狀與進展［J］.煤田地質(zhì)與勘探，2010，38(5):23-27.

［7］蘇現(xiàn)波，陳鑫，王惠風，等.不同厭氧發(fā)酵工藝對煤制氫的影響［J］.煤炭轉(zhuǎn)化，2013，36(2):16-19.

［8］蘇現(xiàn)波，徐影，吳昱，等.鹽度、pH對低煤階煤層生物甲烷生成的影響［J］.煤炭學報，2011，36(8):1302-1306.

［9］Scott A R，Kaise W R，Ayers W B.Thermogenic and secondary biogenci gases，San Juan Basin，Colorado and New Mexico Implications for coalbed gas producibility［J］.AAPG Bulletin，1994，78(8):1186-1209.

［10］Faison B D.The chemistry of low rank coal and its relationship to the biochemical mechanisms of coal biotransformation［J］.In:Crawford D L，Microbial Transformations of Low RankCoals.CRC(Chemical Rubber Company)，1992:1-26.

［11］Hinck M L，F(xiàn)erguson J，Puhaakka J.Resistance of EDTA and DTPA to aerobic biodegradation［J］.Water Science and Technology，1997，35(2-3):25-31.

［12］汪涵，林海，董穎博，等.外源產(chǎn)甲烷菌降解褐煤產(chǎn)氣實驗［J］.石油勘探與開發(fā)，2012，39(6):764-768.

［13］馬萬里，Josquin Tibbits，Mark Adams.一種可用于 PCR 擴增的直接提取土壤細菌DNA的方法［J］.土壤通報，2004，35(1):56-58.

［14］張萬芹，康冀川，王開功.產(chǎn)甲烷細菌分離純化特征的研究［J］.興義民族師范學院學報，2010，2:113-116.

［15］周葉鋒，廖曉蘭.影響甲烷排放量的兩種細菌——產(chǎn)甲烷細菌和甲烷氧化菌的研究進展［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2007，26(增刊):340-346.

［16］龐德公，楊紅建.產(chǎn)甲烷菌的分離純化培養(yǎng)及其培養(yǎng)基對于菌株的選擇作用［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(6):32-35.

［17］林海，隋夢琪，汪涵.微生物增產(chǎn)煤層氣菌種的馴化［J］.煤炭學報，2012，37(8):1359-1363.

［18］郝鮮俊，洪堅平，高文俊.產(chǎn)甲烷菌的研究進展［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學，2007，35(1):111-113.

［19］李美群，鄧潔紅，熊興耀，等.產(chǎn)甲烷菌的研究進展［J］.釀酒科技，2009，(5):90-93.

［20］AIder A C，Siegrist H，Gujer W，et al.Behaviour of NTA and EDTA in biological wastewater treatment［J］.Water Research，1990，24(6):733-742.

［21］Gerike P，F(xiàn)ischer W K.A correlation study of biodegradability determinations with varous chemicals in vatious tests［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，1979，3(2):159-173.

［22］Wilkinson S G..Cell walls of pseudomonas species sensitive to ethylene diaminetetraacetic acid［J］.Journal of Bacteriology，1970，104:1035-1044.