李佳林，張存，高源，郝強，王舒寧，張偉，張英起

1.腫瘤生物學國家重點實驗室；2.第四軍醫(yī)大學 藥學系生物制藥學教研室；陜西 西安 710032

白細胞介素15（interleukin-15，IL-15）是一種多功能細胞因子，是1994年Grabstein等從猿猴的腎上皮細胞中發(fā)現(xiàn)的，相對分子質(zhì)量為（14～15）×103[1]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-15在T細胞、NK細胞、NKT細胞及樹突狀細胞等免疫細胞的發(fā)育、功能維持方面發(fā)揮重要作用，被看作是天然免疫與獲得性免疫系統(tǒng)之間的紐帶之一[2]，因此在維持自身免疫系統(tǒng)平衡及治療腫瘤、微生物感染、自身免疫病等方面?zhèn)涫荜P(guān)注[3-5]。

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的累及外周關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)炎癥的自身免疫性疾病。大量文獻報道，RA患者血清中IL-15水平明顯增高，且過量表達的IL-15通過多種途徑參與RA的發(fā)病機制[6]。首先，IL-15可以通過與多種細胞因子相互作用促進炎癥的進展。研究發(fā)現(xiàn)，RA中高濃度的IL-15能誘導炎性因子IL-17的過度分泌。IL-15還能一方面直接活化T細胞誘導其合成腫瘤壞死因子α（TNFα），另一方面通過激活NK細胞，通過其與單核細胞的相互作用，促進TNFα的產(chǎn)生[7-9]。另外，IL-15還參與關(guān)節(jié)骨質(zhì)的破壞。IL-15可以一方面通過激活促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB等信號通路誘導單核細胞分化為破骨細胞，另一方面與其他分子相互作用促進成骨細胞的凋亡；還可通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，造成骨質(zhì)損傷[6,10-11]。因此，IL-15已成為RA治療的重要靶點。我們從主動免疫方向入手，通過融合破傷風類毒素（tetanus toxoid，TT）T輔助細胞表位（830～843，QYIKANSKFIGITE），在體外克隆表達了重組人TTIL-15融合蛋白（以下簡稱為rtIL-15），并通過免疫小鼠檢測其免疫原性，為進一步研究IL-15融合蛋白在治療RA中的作用打下基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（雌性，6～8周齡）購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心；大腸桿菌M15、質(zhì)粒pQE-30均由本教研室保存；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA marker DL2000均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；異丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）、瓊脂糖、瓊脂購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司；重組人IL-15及小鼠抗人IL-15單克隆抗體購自R&D公司；氫氧化鋁佐劑購自Brenntag公司。

1.2 pQE-30-TT-IL-15重組表達載體的構(gòu)建

將GenBank中人IL-15基因序列（342 bp）上游引入BamHⅠ酶切位點和TT 830～843表位，下游引入SalⅠ酶切位點，長度共計399 bp的基因序列交由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，克隆入載體pQE-30，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15感受態(tài)細胞，挑單克隆培養(yǎng)。經(jīng)酶切鑒定及上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司DNA測序證實，得到重組融合表達載體pQE-30-TT-IL-15，其中pQE-30載體N端融合6個His。

1.3 rtIL-15在大腸桿菌中的表達

將含pQE-30-TT-IL-15重組質(zhì)粒的工程菌接種于10 mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中，于37℃培養(yǎng)過夜，次日按1%的比例轉(zhuǎn)種于10 mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中，于37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長早期（D600nm約為0.6），加IPTG誘導表達，于37℃振蕩培養(yǎng)4 h，離心收集菌體，SDS-PAGE鑒定，并用灰度掃描軟件分析目的蛋白占菌體總蛋白的比例。

1.4 rtIL-15融合蛋白的純化、復性和鑒定

1.4.1 rtIL-15融合蛋白的純化、復性 將誘導表達的工程菌液于4℃、4000 r/min離心15 min，收集菌體沉淀，超聲波裂解，4℃、12 000 r/min離心20 min，分別收集上清液和沉淀進行SDS-PAGE，分析目的蛋白的表達形式。將沉淀用包涵體洗滌液A（2 mol/L尿素，2%Triton X-100）洗滌2次，離心取沉淀，用8 mol/L尿素溶解，離心后取上清進行鎳柱（Ni-NTA）親和層析純化，分別用10、25 mmol/L咪唑預(yù)洗脫之后，用250 mmol/L咪唑再次洗脫，收集目的蛋白進行梯度透析復性（尿素濃度依次為6、4、2、0 mol/L），最后透析至Tris緩沖液中，-20℃保存。

1.4.2 rtIL-15融合蛋白的Weatern印跡 將純化的rtIL-15行SDS-PADE，隨后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以小鼠抗IL-15單抗為一抗、HRP-兔抗小鼠IgG為二抗進行Western印跡。

1.4.3 rtIL-15融合蛋白的HPLC純度鑒定 取10 μL純化的蛋白樣品（0.5 mg/mL）上樣至Beckman HPLC系統(tǒng)，使用7.5 mm×300 mm G2000SW凝膠柱，在280 nm波長下監(jiān)測出峰情況，通過計算峰面積得出rtIL-15蛋白的純度。

1.5 rtIL-15疫苗的免疫原性測定

1.5.1 免疫小鼠 將18只BALB/c小鼠隨機分為3組，分別為rtIL-15+氫氧化鋁佐劑組（蛋白與氫氧化鋁按體積比1∶1混合）、rtIL-15組和生理鹽水對照組。背部皮下多點注射，每只小鼠每次免疫40 μg rtIL-15/100 μL或100 μL生理鹽水（對照組），每組免疫4次，每次間隔2周。第4次免疫后10 d摘眼球采血，收集抗血清進行鑒定。

1.5.2 ELISA測定血清抗體滴度 用商品化的IL-15溶液包被96孔板（每孔100 ng/100 μL），將不同組別的小鼠血清梯度稀釋后加入孔中與其結(jié)合，再加入HRP標記的二抗（博士德公司），OPD顯色，測定D490nm值，每個樣品均設(shè)3個復孔。

2 結(jié)果

2.1 重組表達載體的鑒定

pQE-30-TT-IL-15重組表達載體（圖1）構(gòu)建完成后，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在390 bp處出現(xiàn)酶切片段，與預(yù)期一致（圖2）。測序結(jié)果也顯示序列正確。

2.2 rtIL-15融合蛋白在大腸桿菌中的表達

工程菌經(jīng)IPTG分別誘導2、3、4 h后進行SDSPAGE，出現(xiàn)一條相對分子質(zhì)量約14 000的蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，說明rtIL-15在大腸桿菌中得到表達，并且誘導4 h后的表達量最高（圖3）。灰度掃描分析，融合蛋白約占菌體總蛋白的20%。收集菌體進行超聲波裂解，發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以不溶性包涵體的形式存在，細菌裂解液上清中（可溶性表達部分）只有少量目的蛋白（圖3）。

圖1 pQE-30-TT-IL-15重組載體結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 rtIL-15融合蛋白的純化、復性和鑒定

用洗滌液A洗滌包涵體2次，離心取沉淀，用8 mol/L尿素溶解，離心后取上清進行鎳柱純化，收集目的蛋白洗脫峰（圖4）。將所得蛋白溶液進行梯度透析復性，最后溶于Tris溶液。將純化復性后的目的蛋白進行Western印跡，結(jié)果顯示目的蛋白與抗IL-15單抗有特異性結(jié)合（圖5）。經(jīng)HPLC測定，目的蛋白純度達到95%以上（圖6）。

2.4 rtIL-15融合蛋白疫苗免疫原性檢測

為了驗證rtIL-15的免疫原性，也同時驗證氫氧化鋁免疫佐劑的作用，分別用rtIL-15+佐劑、rtIL-15和生理鹽水免疫BALB/c小鼠，免疫4次后取小鼠血清，用ELISA檢測抗體滴度，結(jié)果如圖7所示。抗血清中的多抗與IL-15有較好的結(jié)合活性；rtIL-15+佐劑組和rtIL-15組產(chǎn)生的抗IL-15抗體效價分別為1∶100 000和1∶1000。該結(jié)果說明rtIL-15融合蛋白疫苗確實具有免疫原性，并且氫氧化鋁佐劑確實具有增強免疫效果的作用。

圖2 重組表達質(zhì)粒pQE-30-TT-IL-15的酶切鑒定

圖3 重組菌的誘導表達（左）及超聲波裂解（右）的SDS-PADE分析

圖4 目的蛋白親和層析純化的SDA-PADE

3 討論

圖5 純化的目的蛋白的Western印跡

圖6 純化的目的蛋白的HPLC分析

圖7 ELISA檢測rtIL-15的免疫原性

IL-15作為一種重要的前炎性細胞因子，具有促進炎癥發(fā)展、刺激淋巴細胞滑膜細胞、促進骨質(zhì)破壞等作用，與RA有密切關(guān)系，是近年來的研究熱點。針對IL-15的單克隆抗體（AMG714）、IL-15受體γc亞單元的單抗及與IL-15受體特異性結(jié)合的IL-15融合蛋白（IL-15-Fcγ2a）都處于臨床研究中[12-13]。但是，這些免疫治療方法具有用藥量大、病人經(jīng)濟負擔重的缺陷。我們從激發(fā)患者自身免疫反應(yīng)入手，擬發(fā)展一種具有治療作用的IL-15疫苗，可以降低用藥量，從而減輕病人身體和經(jīng)濟負擔。但IL-15是一種自身蛋白，正常情況下機體對其存在免疫耐受。我們采取了融合外源性通用T輔助細胞表位的方法突破機體的免疫耐受，這種策略已成功地應(yīng)用于TNFα、HER2、B7-H1等多種自體疫苗的研究中，并取得了不錯的效果[14-16]。

我們將人IL-15基因克隆到帶有His標簽的原核表達載體pQE-30上，在大腸桿菌中誘導表達了重組人IL-15融合蛋白，但表達形式為包涵體沉淀，為蛋白純化增加了難度。為了達到更好的鎳柱親和層析效果，我們嘗試了不同的包涵體洗滌策略，分別在緩沖液加入不同濃度的尿素、鹽酸胍、β-巰基乙醇、Triton X-100、脫氧膽酸鈉進行摸索，最后發(fā)現(xiàn)含2 mol/L尿素、2%Triton X-100的洗滌液可以在不損失目的蛋白的情況下最大程度地去除雜蛋白。在8 mol/L尿素的強變性條件下，目的蛋白沉淀的二級結(jié)構(gòu)充分打開，His標簽得以完全暴露，經(jīng)過一次親和層析就能達到95%純度的純化效果。最后，經(jīng)過緩慢的梯度透析，獲得了可溶性的目的蛋白純品。純化后的rtIL-15融合蛋白疫苗在氫氧化鋁佐劑存在的條件下免疫小鼠，誘導出高滴度的IL-15特異性抗體，說明rtIL-15融合蛋白疫苗具有很好的免疫原性。在后續(xù)研究中，我們將進一步系統(tǒng)檢測rtIL-15疫苗在RA動物模型中的治療效果及免疫機制，為其真正應(yīng)用于臨床打下基礎(chǔ)。

[1]Grabstein K H,Eisenman J,Shanebeck K,et al.Cloning of a T cell growth factor that interacts with the beta chain of the interleukin-2 receptor[J].Science,1994,264(5161):965-968.

[2]Cui G,Hara T,Simmons S,et al.Characterization of the IL-15 niche in primary and secondary lymphoid organs in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(5):1915-1920.

[3]Maeurer M J,Trinder P,Hommel G,et al.Interleukin-7 or interleukin-15 enhances survival of Mycobacterium tuberculo?sis-infected mice[J].Infect Immun,2000,68(5):2962-2970.

[4]Forcina G,D'Ettorre G,Mastroianni C M,et al.Interleukin-15 modulates interferon-gamma and beta-chemokine produc?tion in patients with HIV infection:implications for immunebased therapy[J].Cytokine,2004,25(6):283-290.

[5]Waldmann T A.The biology of IL-15:implications for can?cer therapy and the treatment of autoimmune disorders[J].J Investig Dermatol Symp Proc,2013,16(1):S28-30.

[6]Park M K,Her Y M,Cho M L,et al.IL-15 promotes osteo?clastogenesis via the PLD pathway in rheumatoid arthritis[J].Immunol Lett,2011,139(1-2):42-51.

[7]Petrovic-Rackov L,Pejnovic N.Clinical significance of IL-18,IL-15,IL-12 and TNF-alpha measurement in rheumatoid arthritis[J].Clin Rheumatol,2006;25(4):448-452.

[8]Chao C C,Chen S J,Adamopoulos I E,et al.Anti-IL-17A therapy protects against bone erosion in experimental models of rheumatoid arthritis[J].Autoimmunity,2011,44(3):243-252.

[9]Dalbeth N,Gundle R,Davies R J,er al.CD56bright NK cells are enriched at inflammatory sites and can engage with monocytes in a reciprocal program of activation[J].J Immu?nol,2004,173(10):6418-6426.

[10]Bulfone-Paus S,Bulanova E,Pohl T,et al.Death deflected:IL-15 inhibits TNF-alpha-mediated apoptosis in fibroblasts by TRAF2 recruitment to the IL-15Ralpha chain[J].FASEB J,1999,13(12):1575-1585.

[11]Miranda-Carus M E,Benito-Miguel M,Balsa A,et al.Periph?eral blood T lymphocytes from patients with early rheumatoid arthritis express RANKL and interleukin-15 on the cell sur?face and promote osteoclastogenesis in autologous monocytes[J].Arthritis Rheum,2006,54(4):1151-1164.

[12]Itano A A,Sims M J,Siu G.Mechanistic medicine:novel strategies for clinical trials[J].Autoimmunity,2010,43(7):560-71.

[13]Baslund B,Tvede N,Danneskiold-Samsoe B,et al.Targeting interleukin-15 in patients with rheumatoid arthritis:a proofof-concept study[J].Arthritis Rheum,2005,52(9):2686-2692.

[14]Dalum I,Butler D M,Jensen M R,et al.Therapeutic antibod?ies elicited by immunization against TNF-alpha[J].Nat Bio?technol,1999,17(7):666-669.

[15]Renard V,Sonderbye L,Ebbehoj K,et al.HER-2 DNA and protein vaccines containing potent Th cell epitopes induce dis?tinct protective and therapeutic antitumor responses in HER-2 transgenic mice[J].J Immunol,2003,171(3):1588-1595.

[16]Zhang C,Wang W,Qin X,et al.B7-H1 protein vaccine in?duces protective and therapeutic antitumor responses in SP2/0 myeloma-bearing mice[J].Oncol Rep,2013,30(5):2442-2448.