鄧承蓮，董立厚，鄒佳，宋海峰

1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530002；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥代動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850

分子靶向治療是近年來腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，與傳統(tǒng)化療藥物相比，這類藥物具有靶向性、非細(xì)胞毒性、療效明顯等特點(diǎn)，主要對(duì)腫瘤細(xì)胞起調(diào)節(jié)和穩(wěn)定作用[1-2]。作為治療B細(xì)胞淋巴瘤的靶向藥物，抗CD20單克隆抗體在治療性抗體中占有重要的一席之地，因此，其藥代動(dòng)力學(xué)與毒代動(dòng)力學(xué)研究也隨之成為一大熱點(diǎn)。

自1997年第一個(gè)抗CD20單克隆抗體利妥昔單抗（rituximab）獲準(zhǔn)上市至今，該類藥物發(fā)展迅速，根據(jù)其不同的結(jié)構(gòu)、人源化程度及Fc段修飾等，大致經(jīng)歷了三代研發(fā)[3]。已報(bào)道的針對(duì)這類藥物的檢測(cè)分析方法主要為酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）[4-5]，另外也有流式細(xì)胞法[6-7]和Gyros法[8]等。本研究中，我們選用重組抗CD20人源化單克隆抗體（rh-anti-CD20zumab）作為目標(biāo)藥物。該抗體是基于利妥昔單抗的結(jié)構(gòu)經(jīng)人源化改造而成，可通過與B細(xì)胞表面的CD20分子結(jié)合，經(jīng)抗體依賴性細(xì)胞毒作用（an?tibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC）和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用（complement dependent cyto?toxicity，CDC）等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[9-10]。針對(duì)該抗體，我們建立了2種不同的夾心ELISA法用于定量檢測(cè)生物基質(zhì)中rh-anti-CD20zumab的濃度，并對(duì)其方法學(xué)進(jìn)行較為全面驗(yàn)證，試圖為后續(xù)的rh-anti-CD20zumab在食蟹猴體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供不同的分析方法。

本研究中采用不同的分析方法進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，得到的結(jié)果可以相互印證，從而可提高分析方法的準(zhǔn)確性。同時(shí)，我們對(duì)2種方法進(jìn)行了比較，為類似治療性抗體的臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了不同的研究路線，不同實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身試劑的獲取難易程度而選擇不同的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

rh-anti-CD20zumab（批號(hào)：20121101，純度＞98%，上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）；山羊抗人IgG F(ab')2抗體（批號(hào)：104172，Jackson ImmunoResearch公司）；驢抗人IgG Fc抗體（批號(hào)：105065，Jackson Im?munoResearch公司）；HRP標(biāo)記的猴血清吸附的山羊抗人IgG多克隆抗體（批號(hào)：A80-319P-15，Bethyl公司）；小鼠IgG（批號(hào)：ab37355，Abcam公司）。

96孔酶標(biāo)板（Nunc公司）；微量加樣器（Brand公司）；洗板機(jī)（Thermo公司，型號(hào)為4MK2）；酶標(biāo)儀（Thermo公司，型號(hào)為MK3）。

1.2 捕獲抗體為山羊抗人IgG F（ab'）2抗體的夾心ELISA法

①包被：用山羊抗人IgG F（ab'）2抗體包被酶標(biāo)板，100 μL/孔，4℃靜置過夜后用洗板液洗板3次；②封閉：以1%I-Block為封閉液，300 μL/孔封閉反應(yīng)2.5 h，用洗板液洗板3次；③加樣：用100%食蟹猴空白血漿將rh-anti-CD20zumab標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋至10 000～20 ng/mL，另用同樣方法單獨(dú)配制濃度為3750、1500、100 ng/mL的質(zhì)控樣品；用稀釋液（PBS緩沖液加0.5%Tween-20和1 mol/L NaCl）對(duì)所有血漿樣品進(jìn)行1∶20前處理，每個(gè)前處理后的樣品以100 μL/孔加入酶標(biāo)板中，每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)復(fù)孔，室溫孵育2.5 h，用洗板液洗板3次；④加酶標(biāo)二抗：加入25 ng/mL HRP標(biāo)記的猴血清吸附的山羊抗人IgG抗體，室溫孵育55 min，用洗板液洗板6次；⑤顯色與測(cè)定：加入TMB避光顯色15 min，1 mol/L硫酸終止顯色，酶標(biāo)儀比色讀取D450nm值。

1.3 捕獲抗體為驢抗人IgG Fc抗體的夾心ELISA法

①包被：用驢抗人IgG Fc抗體包被酶標(biāo)板，100 μL/孔，4℃靜置過夜后用洗板液洗板3次；②封閉：以 1%I-Block為封閉液，300 μL/孔，封閉反應(yīng)3 h，用洗板液洗板3次；③加樣：用100%食蟹猴空白血漿將rh-anti-CD20zumab標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋至25 000～20 ng/mL，另用同樣方法單獨(dú)配制濃度為10 000、4000、110 ng/mL的質(zhì)控樣品；用稀釋液（同上）對(duì)所有血漿樣品進(jìn)行1∶10前處理，每個(gè)前處理后的樣品以100 μL/孔加入酶標(biāo)板中，每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)復(fù)孔，室溫孵育3 h，用洗板液洗板3次；④加酶標(biāo)二抗：加入30 ng/mL猴血清吸附HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體，室溫孵育55 min，用洗板液洗板6次；⑤顯色與測(cè)定：加入TMB避光顯色15 min，1 mol/L硫酸終止顯色，酶標(biāo)儀比色讀取D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 特異性

考察結(jié)構(gòu)類似物小鼠IgG對(duì)2種方法的干擾情況。按照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法制成高濃度質(zhì)控樣品和低濃度質(zhì)控樣品，并使其中含有10倍或1倍定量上限（ULOQ）濃度的小鼠IgG。捕獲抗體為山羊抗人IgG F（ab'）2的夾心ELISA法中，在高、低質(zhì)控樣品中均分別加入50 000和5000 ng/mL的小鼠IgG后，rh-anti-CD20zumab的平均分析回收率（%AR）分別為122.5%和122.1%、107.6%和107.1%。捕獲抗體為驢抗人IgG Fc抗體的夾心ELISA法中，在高、低質(zhì)控樣品中均分別加入250 000和25 000 ng/mL的小鼠IgG后，rh-anti-CD20zumab的平均分析回收率分別為114.4%和106.9%、81.5%和81.5%。這表明在獼猴血漿中存在50 000 ng/mL（包被抗體為山羊抗人IgG F（ab'）2抗體）和125 000 ng/mL（包被抗體為驢抗人IgG Fc抗體）的小鼠IgG時(shí)，均不會(huì)影響待測(cè)抗體的準(zhǔn)確性，但后者優(yōu)于前者。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

用100%食蟹猴血漿配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，批間重復(fù)5次。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用相同濃度下各批回算平均值之間的變異系數(shù)（CV）和相對(duì)誤差（RE）來評(píng)價(jià)。結(jié)果見圖1。2種方法的CV分別小于7.3%和11.1%，RE分別為-16.5%～13.2%和-4.4%～3.9%，均滿足生物技術(shù)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)要求，標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的線性和重現(xiàn)性。2種方法的線性范圍分別為40～5000和40～12 500 ng/mL，具有相同的靈敏度，但捕獲抗體為山羊抗人IgG Fc抗體的夾心ELISA法的線性范圍更寬。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

不同實(shí)驗(yàn)日期進(jìn)行5批樣品驗(yàn)證，結(jié)果見表1。捕獲抗體為山羊抗人IgG F（ab'）2抗體的夾心ELISA法中，各級(jí)別驗(yàn)證樣品的準(zhǔn)確度RE為-10.3%～16.6%，板內(nèi)和板間精密度CV≤16.2%；捕獲抗體為驢抗人IgG Fc抗體的夾心ELISA法中，各級(jí)別驗(yàn)證樣品的準(zhǔn)確度RE為-14.4%～12.9%，板內(nèi)和板間精密度CV≤19.4%，均符合方法學(xué)確證要求，兩者相近。

2.4 稀釋線性和鉤狀效應(yīng)

考察樣品稀釋對(duì)樣品濃度檢測(cè)準(zhǔn)確度的影響。捕獲抗體為山羊抗人IgG F（ab'）2抗體的夾心ELISA法中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分別用100%食蟹猴空白血漿配制濃度分別為250 000、25 000、6000 ng/mL的樣品溶液，考察稀釋率為1/1000、1/500、1/50、1/5和1/2的稀釋效應(yīng)；捕獲抗體為驢抗人IgG Fc抗體的夾心ELISA法中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分別用100%食蟹猴空白血漿配制濃度分別為200 000、20 000、8000 ng/mL的樣品溶液，考察稀釋率為1/500、1/100、1/50、1/5、1/2的稀釋效應(yīng)。結(jié)果見表2。將已知濃度的rh-anti-CD20zumab標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，2種方法的RE分別小于18.6%和13.3%，均符合方法學(xué)確證要求，但后者優(yōu)于前者。

考察2種方法是否具有鉤狀效應(yīng)。捕獲抗體為山羊抗人IgG F（ab'）2抗體的夾心ELISA法中，考察3 000 000、300 000、30 000、3000、300 ng/mL濃度點(diǎn)，結(jié)果表明D450nm值隨著樣品濃度的增加而增加，在3 000 000～300 ng/mL范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)；捕獲抗體為驢抗人IgG Fc抗體的夾心ELISA法中，考察 3 000 000、300 000、30 000、6000、1200 ng/mL濃度點(diǎn)，結(jié)果表明D450nm值隨著樣品濃度的增加而增加，在3 000 000～1200 ng/mL范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。

3 討論

圖1 2種ELISA法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=5）

表1 2種ELISA法的精密度和準(zhǔn)確度（n=5）

免疫學(xué)分析方法包括ELISA、放射免疫測(cè)定（RIA）和熒光免疫分析（IFA）等，其中ELISA為公認(rèn)的較為快捷靈敏的方法[4]。本研究中，我們以重組抗CD20人源化單克隆抗體作為待測(cè)物，分別選用抗人IgG F（ab'）2抗體和抗人IgG Fc抗體作為捕獲抗體，建立了2種靈敏高效的夾心ELISA法，試圖為后續(xù)rh-anti-CD20zumab在食蟹猴體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供不同的分析方法。其中，捕獲抗體為抗人IgG F（ab'）2抗體的雙抗體夾心ELISA法中，捕獲抗體針對(duì)的是rh-anti-CD20zumab 的 F（ab'）2段；捕獲抗體為抗人IgG Fc抗體的雙抗體夾心ELISA法中，捕獲抗體針對(duì)的是rh-anti-CD20zumab的Fc段。結(jié)果表明，對(duì)于配制在全血漿基質(zhì)中的藥物而言，這2種分析方法的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、特異性、稀釋線性等各項(xiàng)驗(yàn)證指標(biāo)均符合藥代動(dòng)力學(xué)研究的要求。雖然兩者的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度相同或相近，但后者的線性范圍更寬，并且稀釋線性和特異性更好。整體來說，后者優(yōu)于前者，2種分析方法均可用于rh-anti-CD20zumab的臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究，并且也為其他類似抗體的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了2條合適的研究路線。

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