郄霜，戴振華，楊錫琴，修冰水 ，陳堃 ，郭蘭芹，馮曉燕，張慶波，張賀秋

1.河北聯(lián)合大學(xué)，河北 唐山 063000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.華北石油總醫(yī)院，河北 任丘 062552

結(jié)核分枝桿菌感染所導(dǎo)致的結(jié)核病對(duì)人類健康依然是極大的威脅，全世界高達(dá)三分之一的人口是潛在的結(jié)核分枝桿菌感染患者，每年平均死亡人數(shù)達(dá)到170萬(wàn)[1]。目前我國(guó)結(jié)核病診斷及流行病學(xué)調(diào)查主要采用結(jié)核菌素純蛋白衍化物（PPD）檢測(cè)，但PPD檢測(cè)包含的抗原復(fù)雜，導(dǎo)致難以區(qū)別結(jié)核桿菌感染和卡介苗接種，因此，尋找特異性更高、敏感性更強(qiáng)的抗原是目前結(jié)核病診斷研究的首要任務(wù)。

致病性結(jié)核分枝桿菌區(qū)別于卡介苗（BCG）的一個(gè)重要特征是，結(jié)核分枝桿菌的基因組中存在RD1區(qū)，而所有環(huán)境分枝桿菌及BCG中均缺失該區(qū)序列。研究表明，敲除RD1區(qū)的結(jié)核分枝桿菌H37RV與BCG疫苗株的毒力相當(dāng)，因此推斷RD1區(qū)與細(xì)菌的毒力有關(guān)[2]。我們對(duì)H37RV株RD1區(qū)的Rv3871抗原優(yōu)勢(shì)肽段進(jìn)行了克隆、表達(dá)及純化，初步檢測(cè)了其抗原性，希望為結(jié)核病的臨床檢測(cè)提供新型抗原。

1 材料和方法

1.1 材料

所有血清均來(lái)自北京市朝陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，全部為臨床新近診斷的活動(dòng)性肺結(jié)核患者，未合并感染HIV，未接受抗結(jié)核治療或治療時(shí)間不超過(guò)2周；陰性對(duì)照組來(lái)自健康獻(xiàn)血員。

結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA、大腸桿菌HB101由本室保存；在大腸桿菌中高效表達(dá)目的基因的載體pBVIL1由本室構(gòu)建；實(shí)驗(yàn)所需DNA限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和XbaⅠ，及T4DNA連接酶均購(gòu)自Promega公司。

1.2 抗原表位分析

用Biosun分子生物學(xué)軟件對(duì)Rv3871抗原進(jìn)行表位分析，將其分成3個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位，分別為Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3。

1.3 基因克隆與載體構(gòu)建

針對(duì)用Biosun軟件分析而得的Rv3871的3段優(yōu)勢(shì)肽段基因序列及質(zhì)粒pBVIL1克隆位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)PCR引物。Rv3871-1基因上游引物為P1（5'-GCC TCGAGACTGCTGAACCGGAAGTACGGA-3'），下游引物為 P2（5'-GCTCTAGAACCGGGCCATCCGTCG ATGAT-3'）；Rv3871-2基因上游引物為 P3（5'-GC CTCGAGATCGCTTCCCAGCACACCGAA-3'），下 游引物為 P4（5'-GCTCTAGAAATCTCCCAGCGAGTG CGGTA-3'）；Rv3871-3基因上游引物為P5（5'-GC CTCGAGATCGCTTCCCAGCACACCGAA-3'），下 游引物為 P6（5'-GCTCTAGAACCGGGCCATCCGTCG ATGAT-3'）。上、下游引物5'端分別引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)。

以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括H37Rv株基因組DNA 1.0 μL、超純水45 μL、酶50 μL、引物各2.0 μL，總體積為100 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用DNA膠回收試劑盒純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物，由中美泰和生物技術(shù)公司測(cè)序，將測(cè)序正確的目的基因用XhoⅠ和XbaⅠ酶切，并將其與經(jīng)相同酶切的pBVIL1原核表達(dá)載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，對(duì)氨芐西林（Amp）抗性培養(yǎng)菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆用于誘導(dǎo)表達(dá)。

1.4 表達(dá)純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，挑取單一克隆接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp），37℃搖床振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1∶100的比例接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp），37℃振搖培養(yǎng)2～3 h，轉(zhuǎn)至42℃水浴誘導(dǎo)表達(dá)4 h以上，收集菌體，提取包涵體與上清，進(jìn)行SDSPAGE。重組蛋白的純化參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

1.5 活性檢測(cè)

用純化的結(jié)核分枝桿菌抗原Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3分別包被酶聯(lián)測(cè)定板，用間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)核陽(yáng)性患者和健康獻(xiàn)血員，測(cè)定D450nm值，評(píng)價(jià)抗原的反應(yīng)活性。

2 結(jié)果

2.1 抗原表位分析

圖1 Biosun分子生物學(xué)軟件對(duì)Rv3871抗原的分析結(jié)果

用Biosun分子生物學(xué)軟件對(duì)Rv3871抗原進(jìn)行抗原表位分析，將Rv3871抗原分成3個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位，分別為 Rv3871-1（10～190 aa）、Rv3871-2（310～370 aa）和Rv3871-3（510～580 aa）（圖1）。

2.2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳鑒定

以H37Rv基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3抗原基因片段，相應(yīng)的PCR產(chǎn)物大小分別為540、180和210 bp（圖2）。

2.3 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定

用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切擴(kuò)增的基因，得到相應(yīng)的目的基因，連接到經(jīng)同樣雙酶切的pBVIL1載體上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果表明所擴(kuò)增的基因序列完全正確（序列略）。

2.4 抗原的表達(dá)純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，對(duì)經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行熱誘導(dǎo)。由于目的基因與載體上的一段IL1基因相融合，因此表達(dá)的Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別約為 39.2×103、21.6×103和 22.5×103。將大量誘導(dǎo)表達(dá)的菌體用超聲波破碎，對(duì)表達(dá)于包涵體內(nèi)的各重組蛋白進(jìn)行離子交換柱純化。相關(guān)SDS-PAGE結(jié)果如圖3。

2.5 間接ELISA檢測(cè)抗原活性

圖2 抗原基因片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果

分別用純化的抗原Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3包被酶聯(lián)板，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)40例結(jié)核病患者、36例健康體檢者，對(duì)檢測(cè)結(jié)果用Graph?Pad Prism 4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定cut-off值，表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。對(duì)3個(gè)抗原優(yōu)勢(shì)肽段進(jìn)行IgG檢測(cè)，Rv3871-1的敏感性為32.5%（13/40，t=6.091，P＜0.001），特異性為97.2%；Rv3871-2的敏感性為45%（18/40，t=5.756，P＜0.001），特異性為100%；Rv3871-3的敏感性為37.5%（15/40，t=4.847，P＜0.001），特異性為91.6%。Rv3871-2優(yōu)勢(shì)肽段的檢測(cè)效果最佳。參見(jiàn)表1、2。

3 討論

圖3 重組菌的SDS-PAGE

表1 抗原優(yōu)勢(shì)肽段Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3的ELISA檢測(cè)結(jié)果

表2 抗原優(yōu)勢(shì)肽段Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3的特異性和敏感性

圖4 Rv3871-1、Rv3871-2和Rv3871-3抗原的活性

對(duì)于結(jié)核病的血清學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)試劑的敏感性與特異性一直是困擾科研工作者和醫(yī)務(wù)人員的難題，其主要原因是檢測(cè)試劑所用的抗原種類和質(zhì)量問(wèn)題仍未解決。因此，尋找敏感性高、特異性好的結(jié)核病診斷抗原一直是研究重點(diǎn)[6]。目前比較成熟的結(jié)核病診斷試劑盒大多選用分泌性抗原或多抗原聯(lián)合檢測(cè)[7]。本研究主要針對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv株RD1區(qū)編碼蛋白進(jìn)行。RD1區(qū)編碼蛋白（Rv3871～Rv3879c）是結(jié)核分枝桿菌在長(zhǎng)期傳代過(guò)程中丟失的特異性保護(hù)性抗原，僅存在于致病性結(jié)核分枝桿菌中，在BCG及環(huán)境分枝桿菌中缺失[8]，從而使其在結(jié)核病的免疫學(xué)診斷和預(yù)防中發(fā)揮重要作用。Rv3871是膜結(jié)合ATP水解酶的組成部分，是轉(zhuǎn)錄形成單位，有2個(gè)ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)[9]。

目前關(guān)于Rv3871蛋白的研究較少。我們對(duì)Rv3871抗原進(jìn)行了表位分析，將該抗原分成3段，利用本室構(gòu)建的原核表達(dá)載體pBVIL1進(jìn)行抗原優(yōu)勢(shì)肽段的表達(dá)純化，發(fā)現(xiàn)3個(gè)抗原優(yōu)勢(shì)肽段都能高效表達(dá)。在先前的研究中，曾用多種載體對(duì)Rv3871抗原進(jìn)行全長(zhǎng)表達(dá)，但均未成功。本研究中，通過(guò)表達(dá)抗原優(yōu)勢(shì)肽段，避免了由于抗原本身分子較大，不易表達(dá)的缺點(diǎn)。

通過(guò)間接ELISA法對(duì)3個(gè)抗原優(yōu)勢(shì)肽段免疫活性進(jìn)行初步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Rv3871-2抗原優(yōu)勢(shì)肽段的敏感性和特異性均高于Rv3871-1和Rv3871-3。由此可以推斷Rv3871-2抗原在3個(gè)抗原中效果最佳。

抗原優(yōu)勢(shì)肽段的檢測(cè)可以克服抗原蛋白分子較大而不易克隆表達(dá)的缺點(diǎn)，同時(shí)也可以克服由于蛋白自身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相互折疊，使線性表位被覆蓋而不能充分表現(xiàn)其抗原活性的缺點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，Rv3871-2抗原在pBVIL1載體中可以高效表達(dá)，同時(shí)該抗原在3個(gè)優(yōu)勢(shì)肽段中活性最好。該抗原可以與其他RD1區(qū)抗原如ESAT-6、CFP-10聯(lián)合用于檢測(cè)，以提高檢出率，同時(shí)又可以保持特異性。但是目前對(duì)Rv3871抗原的研究較少，需要進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣品評(píng)價(jià)，探討抗原在結(jié)核病檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

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