齊長(zhǎng)娥，李德超，朱楊，姚叢姍，Hussein Helal，趙艷宇

佳木斯大學(xué) 附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，黑龍江 佳木斯 154004

口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其主要治療藥物順鉑已廣泛應(yīng)用于臨床，但只有10%～15%的患者病情有所緩解[1-3]，抗腫瘤藥物長(zhǎng)期應(yīng)用的耐藥問(wèn)題是制約其臨床療效的主要原因之一。研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphati?dylinositol-3-kinases，PI3K）信號(hào)傳導(dǎo)通路在腫瘤細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，腫瘤細(xì)胞通過(guò)啟動(dòng)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)其增殖、分化，避免細(xì)胞發(fā)生凋亡[4]，特別是對(duì)癌細(xì)胞耐藥有明顯的作用[5-6]。LY294002是PI3K特異性抑制劑，近年研究表明，LY294002可以增強(qiáng)某些化療藥物的療效，起到化療增敏的作用[8-10]。在此，我們主要探討了PI3K特異性抑制劑LY294002逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥口腔鱗癌細(xì)胞TCA8113/CDDP的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

人口腔舌鱗癌細(xì)胞系TCA8113（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所饋贈(zèng)）；PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路阻滯劑LY294002（Selleck公司）；順鉑（CDDP，齊魯制藥廠）；DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（Gibco公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Sigma公司）；p-Akt單克隆抗體（Ser473）、Akt單克隆抗體、PI3K多克隆抗體（Santa Cruz公司）；鼠抗人β-actin鼠抗人多克隆抗體（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。

1.2 耐藥細(xì)胞系TCA8113/CDDP的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TCA8113細(xì)胞，在含0.3 μg/mL CDDP的DMEM-F12培養(yǎng)基（10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各200 U/mL）中，于5%CO2飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，更換正常培養(yǎng)液，待細(xì)胞正常傳代后重復(fù)加藥1次，在進(jìn)入下一個(gè)濃度（以起始濃度的1倍間歇性加藥）前培養(yǎng)1周[11]，誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生。

1.3 細(xì)胞耐藥指數(shù)的測(cè)定

用0.25%胰酶將耐藥細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為105/mL，接種于96孔板。加藥組的CDDP濃度分別為64、32、16、8、4、2、1和0.5 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72 h；每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h后加入100 μL/孔DMSO，振蕩5 min后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的D490nm值，重復(fù)3次。計(jì)算IC50及耐藥指數(shù)（RI）。

RI=耐藥細(xì)胞系的IC50/親代細(xì)胞的IC50

細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組D490nm值/對(duì)照組D490nm值）×100%

1.4 MTT檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TCA8113和TCA8113/CDDP細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板（200 μL/孔），待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%后將培養(yǎng)液換成分別含5、10、20、40 μmol/L LY294002的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24、48 h（聯(lián)合抑制組：在LY294002作用4 h后，TCA8113細(xì)胞加入0.8 μg/mL CDDP，TCA8113/CDDP細(xì)胞加入5.9 μg/mL CDDP，繼續(xù)作用24 h），每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)作用4 h后終止，每孔加入100 μL DMSO，振蕩5 min后在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的D490nm值，并計(jì)算不同濃度的LY294002及其聯(lián)合順鉑對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。

1.5 Western印跡檢測(cè)p-Akt、Akt、PI3K蛋白的表達(dá)

不同濃度LY294002作用2種腫瘤細(xì)胞4 h后加入CDDP繼續(xù)作用24 h，然后用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次，將細(xì)胞刮下，加入含5%PMSF和1 μmol/L磷酸酶抑制劑的全細(xì)胞裂解液75～100 μL，4℃放置1 h，期間不斷吹打，15 000 r/min、4℃離心20 min，收集上清液進(jìn)行定量分析，進(jìn)行10%的SDS-PAGE，將電泳條帶電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，將膜加到用5%BSA稀釋的Akt抗體（1∶400）、p-Akt抗體（1∶400）、PI3K抗體（1∶600）中，4℃孵育過(guò)夜，用TBST漂洗4次，加入1∶10 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育60 min，加入ECL發(fā)光液，在暗室中壓片、曝光，用Image Lab凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。多組間比較用單因素方差分析，所有結(jié)果均用x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 耐藥細(xì)胞系的建立

TCA8113細(xì)胞經(jīng)0.3 μg/mL CDDP作用后，細(xì)胞間質(zhì)增大，細(xì)胞內(nèi)空泡增多，增殖速度減慢，懸浮死亡較多，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，比其親代細(xì)胞顏色暗，細(xì)胞內(nèi)顆粒堆積，2～3個(gè)月后可見(jiàn)細(xì)胞集落，正常傳代后遞增藥物濃度，1年半左右時(shí)間初步建成TCA8113/CDDP細(xì)胞系，其耐CDDP的濃度為2.9 μg/mL，RI為7.7。

2.2 細(xì)胞抑制率的測(cè)定

LY294002（濃度分別為0、5、10、20、40 μmol/L）聯(lián)合CDDP（濃度分別為0.8、5.9 μg/mL）作用于細(xì)胞24 h，對(duì)于 TCA8113 細(xì)胞，比單用 CDDP（0.8 μg/mL）抑制率分別提高了2%、13%、21%和32%；對(duì)于TCA8113/CDDP 細(xì)胞，比單用 CDDP（5.9 μg/mL）的抑制率分別提高了1%、10%、15%和24%）（圖1、2）。說(shuō)明LY294002對(duì)于CDDP有化療協(xié)同的作用。

2.3 LY294002聯(lián)合CDDP對(duì)p-Akt、Akt及PI3K表達(dá)的影響

在不同濃度LY294002作用下，TCA8113/CDDP細(xì)胞和TCA8113細(xì)胞中PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表達(dá)有顯著差異（P＜0.05）。2組細(xì)胞中，在不同濃度LY294002作用下PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比均差異顯著（均為P＜0.05）。

3 討論

建立腫瘤耐藥細(xì)胞株的方法主要有基因轉(zhuǎn)染法[13]和藥物篩選法[14]。基因轉(zhuǎn)染法是利用質(zhì)粒、微脂體或病毒顆粒等作為載體，將特定的耐藥基因片端轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞，使其在新的細(xì)胞中表達(dá)而形成新的具有化療耐藥性的腫瘤細(xì)胞株。藥物篩選法是將腫瘤細(xì)胞株反復(fù)暴露于化療藥物中，并逐漸增加藥物的濃度，引起細(xì)胞基因譜表達(dá)改變，從而使細(xì)胞株表現(xiàn)出化療耐藥的特性。我們采用藥物篩選法建立耐順鉑的舌磷癌細(xì)胞，起始藥物濃度為0.3 μg/mL，經(jīng)過(guò)1年半左右的時(shí)間初步建立了耐藥性為3.2 μg/mL的TCA8113/CDDP細(xì)胞，耐藥指數(shù)為7.7。與以往其他細(xì)胞的耐藥細(xì)胞起始順鉑濃度3.0 μg/mL有所不同，起始藥物濃度較低。

順鉑應(yīng)用于臨床多種實(shí)體腫瘤如睪丸癌、卵巢癌、食道癌、頭頸部癌和小細(xì)胞肺癌等的治療，而非小細(xì)胞肺癌和直腸癌在一期治療后常產(chǎn)生耐藥性。臨床報(bào)道有多種順鉑導(dǎo)致耐藥的機(jī)制，其中主要包括藥物外流增加、藥物吸收減少、GST-π被激活解毒功能增強(qiáng)、凋亡受限、DNA損傷修復(fù)等[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，CDDP可以激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括ATR、p53及MAPK信號(hào)通路，最終通過(guò)活化Caspase-3促進(jìn)細(xì)胞抗凋亡[17]。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)順鉑初期作用于舌鱗癌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞會(huì)大量死亡，只有少量存活，但經(jīng)過(guò)1年半時(shí)間的培養(yǎng)，細(xì)胞會(huì)對(duì)順鉑產(chǎn)生穩(wěn)定的耐藥性，在順鉑含量為2.86 μg/mL的培養(yǎng)基中可以正常傳代。

圖1 LY294002對(duì)TCA8113和TCA8113/CDDP細(xì)胞的抑制率

PI3K/AKT細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞存活的首要通路，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞惡性增殖、轉(zhuǎn)移，以及對(duì)放、化療的拮抗中起重要作用[18]。p-AKT可將Bad磷酸化，失去與Bcl-XL結(jié)合的能力，恢復(fù)Bcl-2的抗凋亡能力[19]。LY294002能與PI3K競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ATP位點(diǎn)，通過(guò)抑制Akt的激活，能完全特異性地抑制PI3K的活性。本實(shí)驗(yàn)中，隨著LY294002濃度的增大，耐藥和非耐藥口腔鱗癌細(xì)胞的抑制率都增加。這2種不同的細(xì)胞間，耐藥細(xì)胞中AKT、p-AKT、PI3K的表達(dá)要比正常細(xì)胞明顯增高，在同時(shí)用40 μmol/L的LY294002聯(lián)合CDDP作用于2種細(xì)胞時(shí)，耐藥細(xì)胞的PI3K表達(dá)比其親代多39.6%，Akt蛋白多50%，p-AKT蛋白多17%。耐藥細(xì)胞在CDDP的長(zhǎng)期作用下，PI3K/AKT信號(hào)通路的表達(dá)比其親代細(xì)胞TCA8113活躍，TCA8113/CDDP細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活，耐藥細(xì)胞抗凋亡的能力比其親代細(xì)胞要強(qiáng)。如何抑制PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白的表達(dá)，就成為逆轉(zhuǎn)耐藥的一條思路。在同一種細(xì)胞內(nèi)，40 μmol/L的LY294002聯(lián)合順鉑作用于細(xì)胞后，細(xì)胞的抑制率比空白對(duì)照組都高，說(shuō)明40 μmol/L的LY294002與順鉑有藥物協(xié)同作用，同時(shí)蛋白的表達(dá)也比空白和對(duì)照組明顯降低。本研究結(jié)果表明，抑制PI3K/AKT通路可作為抑制順鉑耐藥舌鱗癌細(xì)胞的一種方法。

圖2 LY294002聯(lián)合CDDP作用24 h對(duì)TCA8113和TCA8113/CDDP細(xì)胞的抑制率

圖3 TCA8113和TCA8113/CDDP細(xì)胞中p-Akt、Akt、PI3K蛋白的表達(dá)

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