李朝煒+馮丹+翟會青+劉梅+魏景芳

摘要：以旱稻品種鯤旱1號為材料，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中愈傷組織的誘導(dǎo)、篩選、分化等的影響因素進(jìn)行了研究。將PPA抗蟲基因和bar抗性基因成功導(dǎo)入旱稻愈傷組織，經(jīng)過篩選和分化最終獲得了抗性植株。結(jié)果表明，改良的NB培養(yǎng)基適合于旱稻愈傷組織的誘導(dǎo)；當(dāng)農(nóng)桿菌濃度在OD600 nm為0.2～0.3，侵染時間為20 min時，轉(zhuǎn)化效果最好；用40 mg/L的PPT篩選30 d后，可以獲得抗性愈傷組織；將已篩選的抗性愈傷組織在預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d能有效提高分化率。

關(guān)鍵詞：旱稻；農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3482-05

Main Factors Affecting Upland Rice Transformation Mediated by

Agrobacterium tumefacien

LI Zhao-wei，F(xiàn)ENG Dan，ZHAI Hui-qing，LIU Mei，WEI Jing-fang

（Department of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

Abstract： Using the seeds of upland rice Kunhan No.1 as the experimental materials， the effects of main factors including induction of calli， selection， and regeneration on the upland rice transformation frequency were investigated. The PPA gene and bar resistance gene were successfully transformed into upland rice calli. The resistant plants were obtained by screening and differentiation. The results showed that the improved NB medium was the optimal medium for inducing upland rice calli. The suitable concentration of the Agrobacterium was between 0.2 and 0.3. The incursion time was 20 min. Resistant calli can be obtained after being screened in the selective medium with 40 mg/L PPT for 30 days. The resistant calli were pre-differentiated 5～7 days before differentiation. The differentiation frequency of calli could be increased.

Key words： upland rice； Agrobacterium tumefacien； genetic transformation

收稿日期：2014-03-20

基金項目：國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2011ZX08001-003）

作者簡介：李朝煒（1979-），女，河北衡水人，講師，博士，從事植物分子生物學(xué)和基因工程研究，（電話）0311-81668495（電子信箱）

lizhaowei79@163.com。

旱稻，也被稱作陸稻，是水稻的變異型。其耐旱性強(qiáng)，適于旱地、坡地等干旱生態(tài)環(huán)境下種植。其在形態(tài)、生理等方面與水稻有不少的差別，一般在干旱缺水的生長狀況下表現(xiàn)明顯。據(jù)統(tǒng)計，每生產(chǎn)500 kg旱稻稻谷，用水量則僅為水稻用水量的10%～20%。缺水是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所面臨的嚴(yán)峻考驗之一[1]。此外，我國水資源時空分布不均勻，南方水資源較為充沛，而北方水資源不到全國總量的20%。特別是進(jìn)入7月中下旬，大部分地區(qū)降雨開始明顯減少，而水稻此時處于抽穗灌漿的關(guān)鍵時期，用水需求量很大，同時現(xiàn)有選育和推廣的稻作品種普遍抗旱性不足，致使很多地區(qū)缺水的現(xiàn)狀已成為影響水稻產(chǎn)量的重要原因之一。因此大力推廣適于旱地種植的栽培稻即旱稻栽培種，能節(jié)約大量的農(nóng)業(yè)用水，充分利用土地資源，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益[2]。此外，旱稻采用直播種植的方式，省去了育秧、插秧等環(huán)節(jié)，大大減輕稻農(nóng)的田間勞動量，非常適用于目前國內(nèi)農(nóng)業(yè)勞動力短缺的現(xiàn)狀。

大力發(fā)展旱稻還可為培育優(yōu)質(zhì)稻類新品種打下基礎(chǔ)，而其關(guān)鍵是進(jìn)行品種選育，獲得抗逆、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的旱稻品種。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法這一基因工程手段進(jìn)行改良是稻類作物遺傳轉(zhuǎn)化的首選方式[3-8]。近年來，針對稻類作物遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究絕大多數(shù)是以水稻為研究材料，而關(guān)于旱稻的研究報道則主要集中在雜交育種、抗旱性測定、生理指標(biāo)測定、特定基因的標(biāo)記定位、遺傳多樣性分析等方面[9，10]。由于兩者品種間的明顯遺傳差距，在愈傷組織誘導(dǎo)、抗性篩選、分化再生等方面的具體培養(yǎng)條件差別較大[11-13]。目前已報道的旱稻遺傳效率較低，且不同品種間轉(zhuǎn)化條件差別較大。本研究以高耐旱、大穗大粒型粳旱稻品種鯤旱1號的成熟種子為材料，研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化旱稻的體系中各個關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，為建立穩(wěn)定高效的旱稻轉(zhuǎn)化體系，進(jìn)一步獲得具有抗逆性強(qiáng)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因旱稻奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 旱稻材料 旱稻品種鯤旱1號成熟胚誘導(dǎo)的胚性愈傷組織為受體材料。

1.1.2 質(zhì)粒及菌株 pCAMBIA3301由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。隨后將來自于掌葉半夏的凝集素基因PPA構(gòu)建入該表達(dá)載體，賦予轉(zhuǎn)基因旱稻抗蟲的能力。篩選標(biāo)記基因為bar（Biolaphos resistance gene），編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（Phosphinothricin acetyl transferase，PAT），可對除草劑草丁膦的有效成分膦絲菌素（PPT）產(chǎn)生抗性。農(nóng)桿菌菌株為AGL-1，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 研究采用NB培養(yǎng)基（N6大量元素、B5微量元素、有機(jī)元素、鐵鹽）及MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，添加一定濃度的激素及適量谷氨酰胺、水解酪蛋白和麥芽糖等成分。具體培養(yǎng)基成分見表1。

1.2 方法

1.2.1 種子的滅菌 選取適量子粒飽滿、干凈無霉變的旱稻種子，脫去穎殼，放置在指形管中，先用清水洗兩遍，在超凈臺中加入適量75%的乙醇振蕩消毒1 min，然后棄去液體，再加入適量的0.1%升汞或者有效氯為5%的次氯酸鈉溶液和幾滴吐溫20。滅菌兩次，每次20 min，期間不斷振蕩。隨后棄去液體，用無菌水清洗5次，在三角瓶中浸泡20～30 min，再用無菌水清洗3～5次。將種子撈出，置于放有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中吸干水分。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代 待種子基本干燥之后，用滅菌的小勺或鑷子將種子均勻分布在不同成分的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每一個培養(yǎng)皿放置15～20粒，用封口膜將培養(yǎng)皿封好，置于28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。培養(yǎng)3～4 d后可見愈傷組織明顯形成，培養(yǎng)至7～10 d時，愈傷組織長至綠豆粒大小，此時將長出的芽切去，再繼續(xù)培養(yǎng)20～22 d統(tǒng)計出愈率。

誘導(dǎo)愈傷暗培養(yǎng)約30 d左右，挑選顏色淡黃、質(zhì)地致密，并且愈傷組織表面散落出直徑約1～2 mm的球形愈傷團(tuán)塊，將其繼代到新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于28 ℃暗培養(yǎng)5～7 d。

1.2.3 侵染及共培養(yǎng) 取適量超低溫保存的帶有目的基因的農(nóng)桿菌菌種涂布在YEP固體培養(yǎng)基上，28 ℃下暗培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)基表面長出的農(nóng)桿菌輕輕刮下放入50 mL AAM液體培養(yǎng)基中，于28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h。在繼代培養(yǎng)基中挑選出直徑為2～3 mm的狀態(tài)良好、松脆圓潤的愈傷組織，放入滅菌錐形瓶中，每個錐形瓶大約收集300塊。在搖瓶培養(yǎng)后的菌液中逐漸加入新的AAM培養(yǎng)基，調(diào)整OD600 nm為0.2～0.3，將菌液倒入收集好愈傷組織的錐形瓶中，室溫侵染20 min，期間不時輕搖。棄去菌液，將愈傷組織用無菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)移至鋪有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)3 d。

1.2.4 抗性愈傷的篩選 將共培養(yǎng)后的愈傷組織取出置于滅菌培養(yǎng)瓶中，用無菌水洗滌4～5次，每次充分搖動，然后加入含500 mg/L特美汀的NB液體培養(yǎng)基，室溫靜置10 min。棄去液體，倒入含500 mg/L特美汀與2.0 mg/L 2，4-D的NB液體培養(yǎng)基，封口后室溫80 r/min搖瓶培養(yǎng)1 h，棄去液體，將愈傷組織置于帶有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中吸干水分并放置過夜。再將愈傷組織均勻放置在恢復(fù)培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)5～7 d（恢復(fù)培養(yǎng)基是在NB基本培養(yǎng)基中加入2，4-D 2.0 mg/L）。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)，15 d后繼代一次，繼續(xù)篩選培養(yǎng)15-20 d。

1.2.5 預(yù)分化及分化 將經(jīng)過篩選后新長出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接到預(yù)分化培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)5～7 d。隨后將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，28 ℃暗培養(yǎng)3 d后移至光下，28 ℃培養(yǎng)15 d后挑選新生的幼小嫩芽移至新的分化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)15 d左右。

1.2.6 壯苗及生根 待新生幼苗長至2 cm左右時，移至生根培養(yǎng)基中，28 ℃光照培養(yǎng)3～4周，待誘導(dǎo)出根并且幼苗長至7～10 cm時，從培養(yǎng)基中取出，洗凈根部沾染的培養(yǎng)基，移至育秧盤中（營養(yǎng)土與蛭石按照3∶1混合），繼續(xù)培養(yǎng)10 d左右后即可移入溫室或大田。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

出愈率=（產(chǎn)生愈傷組織的種子個數(shù)/接種的種子個數(shù)）×100%

抗性愈傷率=（抗性愈傷數(shù)/供試愈傷數(shù)）×100%

分化率=（再生植株數(shù)/抗性愈傷數(shù)）×100%

再生率=（再生植株數(shù)/供試愈傷數(shù)）×100%

轉(zhuǎn)化率=（陽性轉(zhuǎn)基因苗數(shù)/供試愈傷數(shù)）×100%

1.2.8 轉(zhuǎn)基因旱稻植株的分子水平鑒定 采用CTAB法從抗性再生旱稻幼苗的新鮮葉片中提取基因組DNA，凝集素基因PPA正向引物為 5′-ATCTCAGGAACAGCGACTTCGAC-3′，反向引物為 5′-TGATGATGAGCTCGCCCTTGTG-3′，擴(kuò)增的目的片段為 510 bp。PCR反應(yīng)采用20 μL體系，具體為： 10×緩沖液2 μL，兩種引物各1 μL（終濃度為 1 pmol/L），基因組DNA 1 μL，2.5 mmol/L的dNTP1.6 μL（終濃度 200 μmol/L），Taq酶0.2 μL（1U），用無菌超純水補(bǔ)足體積至20 μL。PCR程序為：96 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠80 V電泳進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑對旱稻種子滅菌效果的影響

升汞與次氯酸鈉均是植物組織培養(yǎng)常用的消毒劑。本研究采用0.1%升汞和5%次氯酸鈉分別進(jìn)行200粒種子的消毒，隨后接種于以NB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，一周后比較污染率和出愈率。結(jié)果顯示在消毒時間為10、20 min時，兩者處理后的種子污染率及出愈率差別不大。處理時間超過30 min時均能達(dá)到較好的消毒效果（表2）。但隨著處理時間的延長，升汞對植物組織的毒害作用逐漸增大，尤其是消毒時間達(dá)到30 min以上時，種子胚部明顯變黑，出愈率顯著降低。加之升汞粉末經(jīng)吸入、食入或者經(jīng)皮膚吸收均對人體有毒害作用，因此本研究采用次氯酸鈉處理40 min作為滅菌條件。

2.2 不同培養(yǎng)基成分對旱稻愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

本研究在旱稻愈傷組織培養(yǎng)階段采用NB和MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)并加以優(yōu)化。結(jié)果顯示，這兩種培養(yǎng)基均可在5～7 d開始誘導(dǎo)出愈傷組織，但對愈傷組織的誘導(dǎo)效率明顯不同，NB培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)效率明顯高于MS培養(yǎng)基，具體見表3。此外，這兩種培養(yǎng)基所誘導(dǎo)出的愈傷組織的狀態(tài)也有所不同。NB培養(yǎng)基上的愈傷組織呈淡黃色，較為整齊，顆粒致密且形態(tài)圓潤；MS培養(yǎng)基上的愈傷組織顏色較為暗淡，松散易碎，且容易褐化。因此，本研究以NB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)并進(jìn)行改良，比較了蔗糖和麥芽糖分別作為碳源以及是否添加脯氨酸時愈傷組織的生長狀態(tài)。結(jié)果顯示，當(dāng)以蔗糖為碳源并添加脯氨酸時，誘導(dǎo)出的愈傷組織顏色較深且容易褐化。當(dāng)去掉脯氨酸并將碳源換為麥芽糖時，愈傷組織為淡黃色且狀態(tài)良好。

另外，還分別進(jìn)行了2，4-D終濃度分別為2 、3 和4 mg/L的試驗，結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)基中2，4-D濃度的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)效率略有上升但差異并不大，但較高濃度的2，4-D會使愈傷組織變得較為細(xì)碎，不適于后續(xù)的轉(zhuǎn)化試驗，因此在本研究中2，4-D的使用濃度為2 mg/L。

2.3 PPT對旱稻抗性愈傷組織的篩選條件

據(jù)以往文獻(xiàn)報道，粳稻的PPT篩選濃度較秈稻略高，一般秈稻的篩選濃度多為10～20 mg/L，而粳稻多為20～30 mg/L[5，14-16]。本研究所用的旱稻鯤旱1號為粳稻和爪哇稻遠(yuǎn)緣雜交獲得，因此選擇20、30、40、50 mg/L等幾個濃度進(jìn)行旱稻愈傷組織的除草劑耐受程度試驗，以確定適宜的PPT選擇濃度。

每種濃度分別接入100塊愈傷組織，27 ℃暗培養(yǎng)3～4周后統(tǒng)計愈傷組織的生長及存活狀況，之后將存活愈傷組織轉(zhuǎn)接入分化培養(yǎng)基，27 ℃光照條件下培養(yǎng)3周后統(tǒng)計能夠形成綠點(diǎn)的愈傷數(shù)，據(jù)此計算分化率。不同濃度PPT處理時愈傷組織的生長情況如表4。表4結(jié)果顯示，在不同濃度PPT處理時，愈傷組織生長速度均明顯減慢。PPT為30 mg/L和40 mg/L的培養(yǎng)基上，可明顯抑制未轉(zhuǎn)化愈傷組織的生長，存活率分別為29%和23%；PPT為50 mg/L的培養(yǎng)基上，愈傷組織生長狀態(tài)很差，絕大多數(shù)發(fā)生褐化死亡。結(jié)合分化率的數(shù)據(jù)，將選擇培養(yǎng)基中的PPT濃度設(shè)定為40 mg/L。

2.4 農(nóng)桿菌的菌液濃度與侵染時間對旱稻抗性愈傷率和再生率的影響

研究表明，對于選用不同的受體品種和不同的農(nóng)桿菌菌株，最適菌液濃度和侵染時間會有所差別。在本研究中對這兩個因素分別進(jìn)行了摸索。首先采用相同的侵染時間，OD600 nm分別設(shè)定為0.1、0.2、0.3、0.4。隨后在相同的OD600 nm條件下，將侵染時間分別設(shè)定為10、20、30 min。每組試驗選取150塊愈傷組織，分別計算抗性愈傷率及分化率。具體結(jié)果見表5。

由表5可見， 在相同菌液濃度的條件下， 隨著侵染時間的延長， 抗性愈傷率逐漸升高。但當(dāng)OD600 nm為0.4、處理時間達(dá)到20 min以及OD600 nm為0.3、處理時間達(dá)到30 min時，愈傷組織被過度侵染，在后續(xù)篩選階段殘留的農(nóng)桿菌不易清除，極易造成污染導(dǎo)致無法統(tǒng)計數(shù)據(jù)。此外，當(dāng)侵染時間達(dá)到40 min時，由于時間較長，對愈傷組織造成傷害使之活力下降，并且在共培養(yǎng)結(jié)束之后也不易抑菌，無法進(jìn)行后續(xù)試驗，因此沒有作出相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計。

當(dāng)OD600 nm為0.2或0.3，侵染時間為20 min時，抗性愈傷率及再生率較高且差別不大。而當(dāng)OD600 nm為0.2，侵染30min時雖然抗性愈傷率較高，但由于侵染時間長對愈傷組織造成傷害較大，再生率并不高。因此選定OD600 nm為0.2～0.3，侵染時間20 min作為最適試驗條件。

2.5 預(yù)分化培養(yǎng)對旱稻分化率的影響

研究結(jié)果（表6）表明，將篩選得到的抗性愈傷組織在黑暗條件下進(jìn)行5～7 d的預(yù)分化培養(yǎng)，再將其轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基。經(jīng)過預(yù)分化的愈傷組織顏色為乳白色且富有光澤，在分化培養(yǎng)基上生長較快，狀態(tài)良好，分化率較高。而未經(jīng)預(yù)分化的愈傷組織則顏色發(fā)黃且暗淡，生長緩慢，分化率較低且易褐化。主要原因在于預(yù)分化培養(yǎng)基中加入的脫落酸（ABA）具有促進(jìn)植物細(xì)胞吸收營養(yǎng)和協(xié)調(diào)代謝的能力[17]，能夠調(diào)整愈傷組織的生理狀態(tài)，促進(jìn)胚性愈傷組織發(fā)生，因此有利于提高分化率。

2.6 轉(zhuǎn)基因植物的PCR檢測分析

對農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化鯤旱1號獲得的T0代轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了目的基因PPA的PCR檢測。大多數(shù)轉(zhuǎn)化植株中可特異地擴(kuò)增出大小510 bp的目的基因片段，與陽性對照擴(kuò)增結(jié)果完全相同（圖1）。同時以未轉(zhuǎn)化的植株提取基因組DNA作為對照，未擴(kuò)增出目的片段。本研究共選取了300個狀態(tài)良好的愈傷團(tuán)塊進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化，經(jīng)篩選獲得203塊抗性愈傷，經(jīng)分化得到46塊獨(dú)立的T0代轉(zhuǎn)化單株，經(jīng)PCR檢測鑒定其中的38株含有目的基因PPA，轉(zhuǎn)化率為12.7%。

3 討論

3.1 旱稻愈傷組織的誘導(dǎo)條件

不同稻類的基因型差異是影響其轉(zhuǎn)化效率的重要因素[5]，究其根本，主要是受到愈傷組織的誘導(dǎo)效果以及分化與再生的難易程度的影響。在進(jìn)行稻類基因轉(zhuǎn)化研究時，因其成熟種子取材不受季節(jié)限制、出愈率較高，且誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織較易于分化再生，因此被作為愈傷組織的常用外植體來源。為獲得狀態(tài)良好的愈傷組織，本研究針對鯤旱1號胚性愈傷組織的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行了摸索。結(jié)果顯示其在MS和NB培養(yǎng)基上均可形成愈傷組織，但以NB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行誘導(dǎo)時的出愈率及狀態(tài)要好于MS培養(yǎng)基。

有研究顯示在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加適量濃度的脯氨酸能夠增強(qiáng)愈傷組織的代謝活力，促進(jìn)愈傷組織的生長[18，19]，但多應(yīng)用于植物花藥和幼穗組織的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，且其具體作用原理尚不十分明確。而本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)NB及MS培養(yǎng)基中添加一定濃度脯氨酸時，旱稻誘導(dǎo)形成的愈傷組織為土黃色，質(zhì)地細(xì)碎干癟且容易褐化，而去掉脯氨酸后愈傷組織為淡黃色，顆粒致密，生長狀況良好，適于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化。

3.2 PPT濃度對抗性愈傷組織篩選的影響

本研究所選用的篩選標(biāo)記基因為bar基因，目前已成功應(yīng)用于多種重要農(nóng)作物的遺傳轉(zhuǎn)化。因其既可作為標(biāo)記基因使用，在植物體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物又可作為非選擇性的除草劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有實用性，因此涉及的領(lǐng)域日益廣泛[5]。不同物種及同一物種的不同組織的PPT篩選使用濃度往往差異較大，多從1～40 mg/L不等[20]。因此，在研究中針對不同的轉(zhuǎn)化體系均應(yīng)摸索適宜的篩選濃度，對提高轉(zhuǎn)化率具有重要的意義。

試驗發(fā)現(xiàn)，鯤旱1號對PPT的自然耐受性較高，當(dāng)培養(yǎng)基中PPT濃度為20 mg/L及更低時，大量非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠存活并分化成苗。當(dāng)達(dá)到30～40 mg/L時，可使大部分非轉(zhuǎn)化細(xì)胞死亡，但同時PPT濃度為30 mg/L時仍有一小部分存活的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠分化出苗。結(jié)合后續(xù)T0代轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定結(jié)果，為盡可能的降低假陽性率，以40 mg/L的PPT作為旱稻轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織篩選的濃度較為適宜，陽性率可達(dá)到82.6%。

3.3 農(nóng)桿菌侵染條件對轉(zhuǎn)化效果的影響

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行植物組織基因轉(zhuǎn)化時，菌液濃度和浸染時間對轉(zhuǎn)化效率的影響非常大[5，21]。一般來講，較高的菌液濃度或較長的浸染時間可以提高農(nóng)桿菌對植物組織的附著和侵染程度，但如果濃度過高或時間過長，致使農(nóng)桿菌過度生長，易對愈傷組織造成傷害，并且會因不能正常脫菌而導(dǎo)致愈傷組織污染和死亡。反之如菌液的濃度太低或浸染的時間太短，所含農(nóng)桿菌的有效細(xì)胞數(shù)目太少，或者有效地附著在愈傷團(tuán)塊表面的農(nóng)桿菌的量不足，都會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化頻率降低。針對本研究采用的轉(zhuǎn)化體系而言，最適條件為OD600 nm=0.2～0.3，侵染時間為20 min，抗性愈傷率和再生率分別可達(dá)到65%和20%以上。

參考文獻(xiàn)：

[1] 羅良國，任愛勝，王瑞梅，等.我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的水危機(jī)及廣泛開展節(jié)水農(nóng)業(yè)前景初探[J].節(jié)水灌溉，2000（5）：6-12.

[2] 薛全義，荊 宇，華玉凡.略論我國旱稻的生產(chǎn)及發(fā)展[J].中國稻米，2002（4）：5-7.

[3] 劉巧泉，張景六，王宗陽，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[J].植物生理學(xué)報，1998，24（3）：259-271.

[4] 劉元風(fēng)，劉彥卓，賀 紅，等.幾種影響秈稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及再生的因素[J].植物生理學(xué)通訊，2004，40（3）：319-322.

[5] 王 蘭，田 華.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（30）：14594-14596，14628.

[6] CHAN M T， CHANG H H， HO S L， et al. Agrobacterium mediated production of transgenic rice plants expression a chimericamylase promoter glucuronidase gene [J]. Plant Mol Biol， 1993， 22： 491-506.

[7] HIEI Y， OHTA S， KOMARI T， et al. Efficient transformation of rice （Oryza sativa L.） mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA [J]. Plant J， 1994， 6（2）： 271-282.

[8] RASHID H， YOKOI S， TORIYAMA K ， et al. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice [J]. Plant Cell Rep， 1996， 15： 727-730.

[9] 翟 偉，胡小榮，周紅立，等.旱稻的抗旱性及遺傳改良研究現(xiàn)狀[J].植物遺傳資源學(xué)報，2010，11（4）：394-398.

[10] 白麗榮，郭曉麗，蘇長青，等.旱稻研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（5）：1-3.

[11] 石云鷺，丁在松，張 彬，等.影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)旱稻轉(zhuǎn)化效率主要因素的研究[J].作物學(xué)報，2007，33（7）：1135-1140.

[12] 臘紅桂，王化琪，黃大年，等.抗除草劑基因?qū)朐绲荆∣ryza sativa）栽培品種[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報， 2003，11（3）：227-232.

[13] 郭曉麗，白麗榮，時麗冉.不同激素配比對旱稻愈傷組織誘導(dǎo)率的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（8）：81-83.

[14] 葉松青，儲成才，曹守云，等.提高水稻轉(zhuǎn)化效率幾個主要因素的研究[J].遺傳學(xué)報，2001，28（10）：933-938.

[15] 易自力，曹守云，王 力，等.提高根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化水稻頻度的研究[J].遺傳學(xué)報，2001，28（4）：352-358.

[16] 周玲艷，姜大剛，吳 豪，等.潮霉素和PPT對水稻愈傷組織篩選效果的比較[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2003，16（2）：10-15.

[17] 江 玲.植物激素ABA和GA調(diào)控種子休眠和萌發(fā)的研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，23（4）：360-365.

[18] 陸燕鵬，萬邦惠.脯氨酸與丙氨酸對光溫敏核不育水稻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997，18（4）：12-15.

[19] 陳克貴，朱慶麟.脯氨酸對小麥愈傷組織生長的促進(jìn)效應(yīng)[J]. 西北植物學(xué)報，1991，11（2）：135-137.

[20] 崔廣榮，吳 豪，劉耀光.除草劑對轉(zhuǎn)bar基因水稻抗性愈傷的篩選和早期苗的鑒定[J].種子，2004，23（3）：7-10.

[21] 王 歆，于恒秀，曾燕楠，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈稻中秈3037轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及其應(yīng)用[J].分子植物育種，2008，6（3）：457-464.

3.2 PPT濃度對抗性愈傷組織篩選的影響

本研究所選用的篩選標(biāo)記基因為bar基因，目前已成功應(yīng)用于多種重要農(nóng)作物的遺傳轉(zhuǎn)化。因其既可作為標(biāo)記基因使用，在植物體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物又可作為非選擇性的除草劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有實用性，因此涉及的領(lǐng)域日益廣泛[5]。不同物種及同一物種的不同組織的PPT篩選使用濃度往往差異較大，多從1～40 mg/L不等[20]。因此，在研究中針對不同的轉(zhuǎn)化體系均應(yīng)摸索適宜的篩選濃度，對提高轉(zhuǎn)化率具有重要的意義。

試驗發(fā)現(xiàn)，鯤旱1號對PPT的自然耐受性較高，當(dāng)培養(yǎng)基中PPT濃度為20 mg/L及更低時，大量非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠存活并分化成苗。當(dāng)達(dá)到30～40 mg/L時，可使大部分非轉(zhuǎn)化細(xì)胞死亡，但同時PPT濃度為30 mg/L時仍有一小部分存活的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠分化出苗。結(jié)合后續(xù)T0代轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定結(jié)果，為盡可能的降低假陽性率，以40 mg/L的PPT作為旱稻轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織篩選的濃度較為適宜，陽性率可達(dá)到82.6%。

3.3 農(nóng)桿菌侵染條件對轉(zhuǎn)化效果的影響

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行植物組織基因轉(zhuǎn)化時，菌液濃度和浸染時間對轉(zhuǎn)化效率的影響非常大[5，21]。一般來講，較高的菌液濃度或較長的浸染時間可以提高農(nóng)桿菌對植物組織的附著和侵染程度，但如果濃度過高或時間過長，致使農(nóng)桿菌過度生長，易對愈傷組織造成傷害，并且會因不能正常脫菌而導(dǎo)致愈傷組織污染和死亡。反之如菌液的濃度太低或浸染的時間太短，所含農(nóng)桿菌的有效細(xì)胞數(shù)目太少，或者有效地附著在愈傷團(tuán)塊表面的農(nóng)桿菌的量不足，都會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化頻率降低。針對本研究采用的轉(zhuǎn)化體系而言，最適條件為OD600 nm=0.2～0.3，侵染時間為20 min，抗性愈傷率和再生率分別可達(dá)到65%和20%以上。

參考文獻(xiàn)：

[1] 羅良國，任愛勝，王瑞梅，等.我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的水危機(jī)及廣泛開展節(jié)水農(nóng)業(yè)前景初探[J].節(jié)水灌溉，2000（5）：6-12.

[2] 薛全義，荊 宇，華玉凡.略論我國旱稻的生產(chǎn)及發(fā)展[J].中國稻米，2002（4）：5-7.

[3] 劉巧泉，張景六，王宗陽，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[J].植物生理學(xué)報，1998，24（3）：259-271.

[4] 劉元風(fēng)，劉彥卓，賀 紅，等.幾種影響秈稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及再生的因素[J].植物生理學(xué)通訊，2004，40（3）：319-322.

[5] 王 蘭，田 華.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（30）：14594-14596，14628.

[6] CHAN M T， CHANG H H， HO S L， et al. Agrobacterium mediated production of transgenic rice plants expression a chimericamylase promoter glucuronidase gene [J]. Plant Mol Biol， 1993， 22： 491-506.

[7] HIEI Y， OHTA S， KOMARI T， et al. Efficient transformation of rice （Oryza sativa L.） mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA [J]. Plant J， 1994， 6（2）： 271-282.

[8] RASHID H， YOKOI S， TORIYAMA K ， et al. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice [J]. Plant Cell Rep， 1996， 15： 727-730.

[9] 翟 偉，胡小榮，周紅立，等.旱稻的抗旱性及遺傳改良研究現(xiàn)狀[J].植物遺傳資源學(xué)報，2010，11（4）：394-398.

[10] 白麗榮，郭曉麗，蘇長青，等.旱稻研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（5）：1-3.

[11] 石云鷺，丁在松，張 彬，等.影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)旱稻轉(zhuǎn)化效率主要因素的研究[J].作物學(xué)報，2007，33（7）：1135-1140.

[12] 臘紅桂，王化琪，黃大年，等.抗除草劑基因?qū)朐绲荆∣ryza sativa）栽培品種[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報， 2003，11（3）：227-232.

[13] 郭曉麗，白麗榮，時麗冉.不同激素配比對旱稻愈傷組織誘導(dǎo)率的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（8）：81-83.

[14] 葉松青，儲成才，曹守云，等.提高水稻轉(zhuǎn)化效率幾個主要因素的研究[J].遺傳學(xué)報，2001，28（10）：933-938.

[15] 易自力，曹守云，王 力，等.提高根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化水稻頻度的研究[J].遺傳學(xué)報，2001，28（4）：352-358.

[16] 周玲艷，姜大剛，吳 豪，等.潮霉素和PPT對水稻愈傷組織篩選效果的比較[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2003，16（2）：10-15.

[17] 江 玲.植物激素ABA和GA調(diào)控種子休眠和萌發(fā)的研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，23（4）：360-365.

[18] 陸燕鵬，萬邦惠.脯氨酸與丙氨酸對光溫敏核不育水稻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997，18（4）：12-15.

[19] 陳克貴，朱慶麟.脯氨酸對小麥愈傷組織生長的促進(jìn)效應(yīng)[J]. 西北植物學(xué)報，1991，11（2）：135-137.

[20] 崔廣榮，吳 豪，劉耀光.除草劑對轉(zhuǎn)bar基因水稻抗性愈傷的篩選和早期苗的鑒定[J].種子，2004，23（3）：7-10.

[21] 王 歆，于恒秀，曾燕楠，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈稻中秈3037轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及其應(yīng)用[J].分子植物育種，2008，6（3）：457-464.

3.2 PPT濃度對抗性愈傷組織篩選的影響

本研究所選用的篩選標(biāo)記基因為bar基因，目前已成功應(yīng)用于多種重要農(nóng)作物的遺傳轉(zhuǎn)化。因其既可作為標(biāo)記基因使用，在植物體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物又可作為非選擇性的除草劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有實用性，因此涉及的領(lǐng)域日益廣泛[5]。不同物種及同一物種的不同組織的PPT篩選使用濃度往往差異較大，多從1～40 mg/L不等[20]。因此，在研究中針對不同的轉(zhuǎn)化體系均應(yīng)摸索適宜的篩選濃度，對提高轉(zhuǎn)化率具有重要的意義。

試驗發(fā)現(xiàn)，鯤旱1號對PPT的自然耐受性較高，當(dāng)培養(yǎng)基中PPT濃度為20 mg/L及更低時，大量非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠存活并分化成苗。當(dāng)達(dá)到30～40 mg/L時，可使大部分非轉(zhuǎn)化細(xì)胞死亡，但同時PPT濃度為30 mg/L時仍有一小部分存活的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠分化出苗。結(jié)合后續(xù)T0代轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定結(jié)果，為盡可能的降低假陽性率，以40 mg/L的PPT作為旱稻轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織篩選的濃度較為適宜，陽性率可達(dá)到82.6%。

3.3 農(nóng)桿菌侵染條件對轉(zhuǎn)化效果的影響

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行植物組織基因轉(zhuǎn)化時，菌液濃度和浸染時間對轉(zhuǎn)化效率的影響非常大[5，21]。一般來講，較高的菌液濃度或較長的浸染時間可以提高農(nóng)桿菌對植物組織的附著和侵染程度，但如果濃度過高或時間過長，致使農(nóng)桿菌過度生長，易對愈傷組織造成傷害，并且會因不能正常脫菌而導(dǎo)致愈傷組織污染和死亡。反之如菌液的濃度太低或浸染的時間太短，所含農(nóng)桿菌的有效細(xì)胞數(shù)目太少，或者有效地附著在愈傷團(tuán)塊表面的農(nóng)桿菌的量不足，都會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化頻率降低。針對本研究采用的轉(zhuǎn)化體系而言，最適條件為OD600 nm=0.2～0.3，侵染時間為20 min，抗性愈傷率和再生率分別可達(dá)到65%和20%以上。

參考文獻(xiàn)：

[1] 羅良國，任愛勝，王瑞梅，等.我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的水危機(jī)及廣泛開展節(jié)水農(nóng)業(yè)前景初探[J].節(jié)水灌溉，2000（5）：6-12.

[2] 薛全義，荊 宇，華玉凡.略論我國旱稻的生產(chǎn)及發(fā)展[J].中國稻米，2002（4）：5-7.

[3] 劉巧泉，張景六，王宗陽，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[J].植物生理學(xué)報，1998，24（3）：259-271.

[4] 劉元風(fēng)，劉彥卓，賀 紅，等.幾種影響秈稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及再生的因素[J].植物生理學(xué)通訊，2004，40（3）：319-322.

[5] 王 蘭，田 華.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（30）：14594-14596，14628.

[6] CHAN M T， CHANG H H， HO S L， et al. Agrobacterium mediated production of transgenic rice plants expression a chimericamylase promoter glucuronidase gene [J]. Plant Mol Biol， 1993， 22： 491-506.

[7] HIEI Y， OHTA S， KOMARI T， et al. Efficient transformation of rice （Oryza sativa L.） mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA [J]. Plant J， 1994， 6（2）： 271-282.

[8] RASHID H， YOKOI S， TORIYAMA K ， et al. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice [J]. Plant Cell Rep， 1996， 15： 727-730.

[9] 翟 偉，胡小榮，周紅立，等.旱稻的抗旱性及遺傳改良研究現(xiàn)狀[J].植物遺傳資源學(xué)報，2010，11（4）：394-398.

[10] 白麗榮，郭曉麗，蘇長青，等.旱稻研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（5）：1-3.

[11] 石云鷺，丁在松，張 彬，等.影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)旱稻轉(zhuǎn)化效率主要因素的研究[J].作物學(xué)報，2007，33（7）：1135-1140.

[12] 臘紅桂，王化琪，黃大年，等.抗除草劑基因?qū)朐绲荆∣ryza sativa）栽培品種[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報， 2003，11（3）：227-232.

[13] 郭曉麗，白麗榮，時麗冉.不同激素配比對旱稻愈傷組織誘導(dǎo)率的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（8）：81-83.

[14] 葉松青，儲成才，曹守云，等.提高水稻轉(zhuǎn)化效率幾個主要因素的研究[J].遺傳學(xué)報，2001，28（10）：933-938.

[15] 易自力，曹守云，王 力，等.提高根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化水稻頻度的研究[J].遺傳學(xué)報，2001，28（4）：352-358.

[16] 周玲艷，姜大剛，吳 豪，等.潮霉素和PPT對水稻愈傷組織篩選效果的比較[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2003，16（2）：10-15.

[17] 江 玲.植物激素ABA和GA調(diào)控種子休眠和萌發(fā)的研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，23（4）：360-365.

[18] 陸燕鵬，萬邦惠.脯氨酸與丙氨酸對光溫敏核不育水稻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997，18（4）：12-15.

[19] 陳克貴，朱慶麟.脯氨酸對小麥愈傷組織生長的促進(jìn)效應(yīng)[J]. 西北植物學(xué)報，1991，11（2）：135-137.

[20] 崔廣榮，吳 豪，劉耀光.除草劑對轉(zhuǎn)bar基因水稻抗性愈傷的篩選和早期苗的鑒定[J].種子，2004，23（3）：7-10.

[21] 王 歆，于恒秀，曾燕楠，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈稻中秈3037轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及其應(yīng)用[J].分子植物育種，2008，6（3）：457-464.