羅明，魏剛*，陳志輝，黃月純，楊明志，順慶生

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；3.中國(guó)中藥協(xié)會(huì) 石斛專業(yè)委員會(huì)，云南 昆明 650031；4.上海健康職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 200237)

*

魏剛，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥新藥與指紋圖譜分析；E-mail：weigang021@163.com

玫瑰石斛HPLC特征圖譜研究

羅明1，魏剛1*，陳志輝1，黃月純2，楊明志3，順慶生4

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；3.中國(guó)中藥協(xié)會(huì) 石斛專業(yè)委員會(huì)，云南 昆明 650031；4.上海健康職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 200237)

目的建立玫瑰石斛HPLC特征圖譜。方法采用ZORBAX SB-Aq色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.2%甲酸，梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。結(jié)果建立了12批玫瑰石斛HPLC特征圖譜，標(biāo)記出41個(gè)共有峰，相似度為0.901～0.986。結(jié)論該法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，為玫瑰石斛的鑒別提供依據(jù)。

玫瑰石斛；特征圖譜

石斛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并列為上品，謂：“味甘、平，無毒。主傷中，除痹，下氣，補(bǔ)五臟虛勞、羸瘦、強(qiáng)陰。久服厚腸胃，輕身，延年”。石斛在歷版《中國(guó)藥典》中均有收載，2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定石斛來源于金釵石斛、鼓槌石斛和流蘇石斛的栽培品及其同屬植物近似種[1]，其來源未完全明確。目前我國(guó)商品流通的藥用石斛近40種[2]。玫瑰石斛為蘭科植物玫瑰石斛DendrobiumcrepidatumLindl.et Paxt.的干燥莖，產(chǎn)地為云南南部至西南部(勐海、勐臘、鎮(zhèn)康、滄源)及貴州西南部(興義、羅甸)，境外分布于印度、尼泊爾、錫金、不丹、緬甸、泰國(guó)、老撾、越南等地[3]。在云南南部地區(qū)把玫瑰石斛當(dāng)作石斛來使用，是地方用藥的一種。由于長(zhǎng)期過度采收，野生玫瑰石斛的資源已急劇減少，有些地區(qū)甚至瀕臨滅絕[4]?，F(xiàn)代研究表明玫瑰石斛含有生物堿類[5]、茋類化合物[6-7]、黃酮及肉桂酸酯類成分[7]、木質(zhì)素化合物[8]等多種化學(xué)成分。

由于石斛屬植物品種繁多，許多品種之間形態(tài)非常相似，難以區(qū)分，其干燥或加工成楓斗后的藥材則更加難以鑒別，使得市場(chǎng)上的商品石斛良莠不齊、真假不辨[9]。用玫瑰石斛做成的楓斗，是市場(chǎng)上水草楓斗主要來源之一(其余包括兜唇石斛、束花石斛等)，目前已有采用原植物鑒別、性狀鑒別、顯微鑒別等方法對(duì)玫瑰石斛進(jìn)行鑒別的文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]。本文首次建立了玫瑰石斛的HPLC特征圖譜，采用此法可以比較全面、整體地反映玫瑰石斛的內(nèi)在化學(xué)成分，且用于比較不同水草類楓斗有明顯區(qū)別，可為規(guī)范楓斗市場(chǎng)提供方法與積累數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器、LC-20AT泵、DGU-12在線脫氣機(jī)，日本島津公司)；Mettler Toledo AB204-N型精密電子天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛明儀器有限公司)。

1.2 試藥

12批玫瑰石斛鮮品(編號(hào)：S1-S12)分別購于云南文山(S7)、云南昆明(S11、S12)，以及廣州嶺南花卉市場(chǎng)(其余批次)等地，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院黃月純主任中藥師鑒定為玫瑰石斛DendrobiumcrepidatumLindl.et Paxt.，樣品典型圖片見圖1～2。取收集的鮮品玫瑰石斛，除去根、葉和泥沙，用開水略燙，除凈葉鞘，將其剪碎后，在60 ℃下烘干備用。

乙腈，色譜純(德國(guó)Merk公司)；水為純凈水；其他試劑為分析純。

圖1 玫瑰石斛花

圖2 玫瑰石斛新鮮莖條

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-Aq(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸溶液(B)，梯度洗脫：0～40 min為0.5%→10%A，40～100 min為10%→16%A，100～140 min為16%→23%A，140～200 min為23%→40%A；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1。

2.2 供試品溶液的制備

取玫瑰石斛粉末(過60目篩)0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理60 min，取出，放冷，過濾，藥渣及濾紙剪碎同置于錐形瓶中，加80%甲醇20 mL，超聲處理60 min，取出，放冷，濾過，合并2次濾液，60 ℃減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取玫瑰石斛供試品溶液(S3)10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。將獲得的色譜圖導(dǎo)入相似度軟件，平均數(shù)法計(jì)算樣品相似度，結(jié)果相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取玫瑰石斛供試品溶液(S3)10 μL，分別在0，4，8，12，24，36 h進(jìn)樣分析，將獲得的色譜圖導(dǎo)入相似度軟件，平均數(shù)法計(jì)算樣品相似度，結(jié)果相似度均大于0.99，表明供試品溶液在36 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份樣品(S3)，分別制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL進(jìn)樣分析。將獲得的色譜圖導(dǎo)入相似度軟件，平均數(shù)法計(jì)算樣品相似度，結(jié)果相似度均大于0.99，表明重復(fù)性良好。

2.4 樣品檢測(cè)

按供試品溶液的制備方法制備各批次樣品。精密吸取供試品溶液10 μL，按色譜條件進(jìn)樣分析。

2.5 特征圖譜的建立與分析

2.5.1 共有峰的確定 根據(jù)以上樣品的分析結(jié)果，玫瑰石斛共標(biāo)示出41個(gè)特征共有峰，以峰19為參照峰(S)，計(jì)算各特征共有峰相對(duì)保留時(shí)間(RTR)與相對(duì)峰面積(RA)，結(jié)果見表2。

表1 玫瑰石斛HPLC特征圖譜分析

2.5.2相似度分析 采用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)，以平均數(shù)法生成指紋圖譜共有模式，計(jì)算樣品相似度，結(jié)果S1～S12的相似度分別為0.930，0.971，0.952，0.959，0.901，0.962，0.958，0.920，0.940，0.986，0.957，0.961，其生成的重疊圖、共有模式見圖3～4。

圖3 12批玫瑰石斛HPLC特征圖譜重疊圖

圖4 12批玫瑰石斛HPLC特征圖譜共有模式

3 討論

本研究進(jìn)行了供試品溶液的制備方法和色譜條件的考察。提取溶劑考察了甲醇、80%甲醇、乙酸乙酯和三氯甲烷，結(jié)果以甲醇提取后再用80%甲醇提取效果較優(yōu)。提取方法考察了超聲法、回流法和冷浸法，超聲法提取效率高，且操作簡(jiǎn)便，故選擇了此法。此外，還進(jìn)行了提取時(shí)間、溶劑用量、生藥濃度等條件，最終確定2.2項(xiàng)下條件。

色譜條件中考察了乙腈-水，乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.2%醋酸等色譜系統(tǒng)，結(jié)果表明以乙腈-0.2%甲酸為流動(dòng)相時(shí)各色譜峰的分離和峰形效果較佳?？疾炝瞬煌牧魉?0.8,1.0,1.2 mL·min-1)和不同的柱溫(25,30,40 ℃)對(duì)各色譜峰分離度的影響，同時(shí)進(jìn)行了DAD全波長(zhǎng)掃描，最終確定2.1項(xiàng)下色譜條件。

由于目前市場(chǎng)上楓斗商品的基原復(fù)雜，形態(tài)相似，一般的鑒別方法很難將其區(qū)分，這也是造成石斛市場(chǎng)混亂的原因之一。采用特征圖譜的方法，可以從整體上實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制，有利于中藥質(zhì)量的穩(wěn)定和有效[11]。通過12批樣品分析發(fā)現(xiàn)，玫瑰石斛具有較穩(wěn)定的特征指紋峰，相似度達(dá)0.901～0.986。在標(biāo)示出的41個(gè)共有峰中，峰18為第一強(qiáng)峰，其次為峰22、峰11、峰19、峰2。通過特征峰光譜分析，峰1～21為光譜一致的黃酮類成分，在265，350 nm附近有最大吸收，特征峰的鑒別有待進(jìn)一步研究。本研究為玫瑰石斛的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。此外，課題組采用本方法開展了兜唇石斛、束花石斛特征圖譜研究(另文報(bào)道)，結(jié)果顯示3種水草類楓斗的特征圖譜明顯不同，可達(dá)到鑒別的目的。

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HPLCStudyonHPLCCharacteristicSpectrumofDendrobiumcrepidatum

LUOMing1,WEIGang1*,CHENZhihui1,HUANGYuechun2,YANGMingzhi3,SHUNQingsheng4

(1.GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China；2.TheFirstAffiliatedHospital,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China；3.DendrobiumProfessionalCommitteeofChinaAssociationofTraditionalChineseMedicine,Kunming650031,China；4.ShanghaiAcademyofHealthSciences,Shanghai200237,China)

Objective：To establish HPLC characteristic spectrum ofDendrobiumcrepidatum.MethodsChromatographic separation was performed on ZORBAX SB-Aq column at 30 ℃,eluted with acetonitrile and 0.2% methanoic acid in a gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 270 nm.ResultsThe HPLC characteristic spectrum ofDendrobiumcrepidatumwas constructed with 41 common specific chromatographic peaks,and the similarities were 0.901～0.986.ConclusionThe method is accurate,reliable and with good reproducibility.It can be used to identifyDendrobiumcrepidatum.

Dendrobiumcrepidatum；Characteristic spectrum；HPLC；DendrobiumcrepidatumLindl.et Paxt.

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.002

2014-01-04)