臧莎莎，劉頤軒，宋光耀，王 超

(1.河北醫(yī)科大學研究生學院，河北石家莊 050017;2.河北省人民醫(yī)院，河北石家莊 050051)

2型糖尿病的重要特征是胰島素抵抗 (IR)［1］。骨骼肌IR的發(fā)生在整個機體IR中占重要地位。而骨骼肌脂質沉積是誘導骨骼肌IR的主要原因［2］。當機體出現(xiàn)代謝異常尤其是發(fā)生2型糖尿病時，線粒體功能往往已經(jīng)受損［3］，出現(xiàn)線粒體脂肪酸氧化的減少及骨骼肌脂質沉積。降糖中成藥津力達能夠降低患者血糖、膽固醇、甘油三酯水平，改善IR，但其具體機制尚不明確。本研究從骨骼肌線粒體功能的改變及脂質沉積角度探討津力達改善IR的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 中成藥津力達由河北以嶺藥業(yè)提供，國藥準字Z 20050845;津力達為黃棕色顆粒劑，氣微香，味微苦;藥用復合膜包裝，每袋裝9 g，9袋/盒;將津力達顆粒研磨成粉末，用0.5%的羥甲基纖維素鈉配制成為25%的津力達溶液灌胃。鹽酸吡格列酮片，由日本武田制藥有限公司生產，規(guī)格15 mg/片，批號149A;鹽酸吡格列酮研磨成為粉末后用0.5%的羥甲基纖維素鈉配制成0.1%的溶液灌胃。大鼠血清胰島素及游離脂肪酸(FFA)ELISA試劑盒、骨骼肌甘油三酯 (TG)測試盒、骨骼肌FFA測試盒、骨骼肌長鏈脂酰輔酶A(LCACoA)ELISA試劑盒均購自南京建成生物試劑公司;肉堿脂酰轉移酶1(CPT1)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子 (PGC-1α)抗體購于Santa Cruz公司，β-actin抗體及辣根過氧化物酶 (HRP)標記的二抗購自ProteinTech Group公司;ECL化學發(fā)光試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠36只，體質量 (140±20)g，購自中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，許可證號scxk(京)2009-0017，動物合格證號:0270141。

1.3 實驗飼料 基礎飼料購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，熱量組成為碳水化合物65.5%，脂肪10.3%，蛋白質24.2%，總熱量為348 kcal/100 g;自制高脂飼料熱量組成為碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，蛋白質占20.1%，總熱量為501 kcal/100 g。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 36只雄性SD大鼠隨機分為兩組，12只予基礎飼料喂養(yǎng)，24只予高脂喂養(yǎng)。6周后每組各取6只行正葡萄糖高胰島素鉗夾實驗判斷IR模型造模成功?；A飼料喂養(yǎng)的剩余6只繼續(xù)予基礎飼料作為正常對照組;高脂喂養(yǎng)造模成功的18只進一步分組，高脂對照組，吡格列酮治療組給予 4.5 mg/(kg·d)，津力達治療組給予1.5 g/(kg·d)，吡格列酮與津力達溶液用0.5%的羥甲基纖維素鈉配制。津力達及吡格列酮給藥劑量均采用體表面積折算法將臨床用藥劑量等效折算為大鼠用藥劑量。每日灌胃給藥1次，正常、高脂對照組予同體積生理鹽水灌胃，每周測量體質量及統(tǒng)計攝食量。灌胃第8周，腹主動脈放血處死大鼠，留取血清;留取股四頭肌標本，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗 60 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，行右頸動脈、右頸靜脈插管術，導管經(jīng)皮下由耳后引出并固定，用100 IU/mL肝素封管，結扎固定于頸后皮膚。插管術后3～5 d，待大鼠恢復體質量，禁食12 h過夜，次日在特制的鼠籠中行清醒狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗。測定基礎血糖值后，4 mU/(kg·min)勻速輸注胰島素，使大鼠體內的胰島素水平迅速升高。其后每10 min測定一次靜脈血糖，輸注并調整30%葡萄糖溶液的輸注率，使維持血糖在 (5±0.5)mmol/L，連續(xù)3次以上血糖在上述范圍即表明達到穩(wěn)態(tài)，取穩(wěn)態(tài)下5～6次葡萄糖輸注率 (GIR)的平均值作為大鼠胰島素敏感性的評價指標。

1.4.3 血液生化指標、骨骼肌 TG、FFA、LCACoA水平測定 灌胃第8周空腹取血，用快速血糖測定儀測定血糖，并分離血清于-80℃保存，同批測定胰島素、TG、血清膽固醇 (TC)和FFA。血清胰島素、FFA用ELISA試劑盒檢測，血清甘油三酯和總膽固醇采用Beckman X20自動生化儀測定;骨骼肌TG經(jīng)無水乙醇抽提后用TG試劑盒測定，F(xiàn)FA采用銅顯色法測定，LCACoA使用ELISA試劑盒檢測。

1.4.4 骨骼肌 PGC-1α和CPT1蛋白表達 采用Western-blotting方法測定。冷凍的骨骼肌組織稱質量，加入組織裂解液提取蛋白并定量。取30 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉液室溫封閉 4 h，CPT1、PGC-1α、β-actin一抗4℃搖床過夜，洗膜后再加入辣根過氧化物酶 (HRP)標記的二抗，室溫孵育2 h，用ECL化學發(fā)光試劑盒暗室顯影。

1.4.5 RT-PCR檢測 用Trizol法提取小鼠骨骼肌總RNA，RT-PCR采用Syber Green I GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒在ABI PRISM 7300 PCR儀上進行。反應條件:95℃預變性10 min，隨后95℃變性15 s 40個循環(huán)，58℃退火20 s，72℃延伸30 s。Pgc1α正向引物5'-AAGACCAGGAAATCCGAGC-3'，反向引物5'-TTGCCATCCCGTAGTTCAC-3';Cpt1正向引物5'-CCAAACATCACTGCCCAA-3'，反向引物5'-GGAAATAGGCTTCGTCATCC-3';Nrf1正向引物5'-AGACACGGTTGCTTCGGAA-3'，反向引物5'-CGCACCACATTCTCCAAAG-3';CoxⅣ正向引物5'-TCGCTGAGATGAACAAGGG-3'，反向引物5'-AGTGAAGCCGATGAAGAACA-3';Acadm正向引物 5'-TGACGGAGCAGCAGAAAGAG-3'，反向引物5'-TTGATGAGAGGGAACGGGT-3';Pparα正向引物5'-GGTCCGATTCTTCCACTGCT-3'，反向引物5'-GGTAACCTGGTCATTCAAGTC-3';Pparγ 正向引物 5'-CCACCAACTTCGGAATCAG-3'，反向引物5'-GATGTCAAAGGAATGGGAGTG-3';β-actin正向引物 5'-TGTGATGGTGGGTATGGGT-3'，反向引物5'-AGGATGCCTCTCTTGCTCTG-3'。反應結束后，按照各反應孔Ct值，以β-actin基因為內參，根據(jù)公式2-ΔCt計算各樣品目的基因相對表達量。

1.4.6 電鏡觀察 透射電鏡于河北醫(yī)科大學觀察。切取少量肌組織，用銳利眼科剪剪成 (2 mm×2 mm×2 mm)左右的組織方塊，浸泡于2.5%的戊二醛，1%鋨酸固定，常規(guī)電鏡樣品制備程序脫水、滲透、包埋，制備成1 μm的超薄切片，最后在HITACHI H7500型透射電鏡下觀察并攝片。

1.4.7 統(tǒng)計學處理 用spss 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差 ()表示，組間比較用完全隨機設計的單因素方差分析。以 P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠體質量及血液生化指標的比較 與正常組相比，高脂組大鼠體質量明顯增加 (P＜0.05)，津力達及吡格列酮組與高脂組比較體質量降低(P＜0.05)。每日平均攝入熱量津力達、吡格列酮組與高脂組間無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)。高脂組空腹血糖、胰島素、TG、TC、FFA均高于正常組，除TC外都具有統(tǒng)計學差異 (P＜0.05);津力達及吡格列酮組空腹血糖高于正常組，低于高脂組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);津力達及吡格列酮組空腹胰島素、FFA較高脂組降低 (P＜0.05)，與正常組無差別;津力達能夠顯著降低TG，TC(P＜0.05)，吡格列酮組只能降低TG水平 (P＜0.05)。見表1。

2.2 胰島素敏感性評價 高脂組GIR明顯低于正常組 (P＜0.05)，津力達及吡格列酮組GIR較高脂組升高 (P＜0.05)，與正常組無差別。見表1。

表1 各組大鼠體質量、日均攝食、血糖、胰島素、血脂、GIR比較 ()Tab.1 Body weight，energy food intake，blood glucose，insulin，lipid and GIR among groups()

表1 各組大鼠體質量、日均攝食、血糖、胰島素、血脂、GIR比較 ()Tab.1 Body weight，energy food intake，blood glucose，insulin，lipid and GIR among groups()

注:與高脂組相比，*P＜0.05;與正常組相比，#P＜0.05

組別 體質量/g 攝食/(kcal·day-1)血糖/(mmol·L-1)胰島素/(mU·L-1)GIR/% TG/(mmol·L-1)FFA/(mmol·L-1)TC/(mmol·L-1)正常組 471.50±4.53* 87.32±6.01* 4.42±0.16* 11.60±1.17* 27.83±1.15* 0.37±0.03* 0.64±0.05*1.04±0.07高脂組 644.83±15.77# 117.06±6.25# 7.23±0.25# 27.22±1.55# 14.58±0.44# 0.52±0.03# 1.40±0.08# 1.15±0.05吡格列酮組 539.00±10.55*#110.34±7.92 4.85±0.20* 16.39±1.55* 27.53±0.40* 0.23±0.03*#0.76±0.05* 1.01±0.06津力達組 540.67±17.43*#101.59±5.05 5.79±0.24*# 15.38±1.56* 29.10±0.82* 0.15±0.01*#0.76±0.06* 0.75±0.05*

2.3 各組大鼠骨骼肌TG、FFA、LCACoA水平比較 高脂組骨骼肌TG、FFA、LCACoA水平均高于正常組 (P＜0.05)，津力達及吡格列酮組 TG、FFA、LCACoA水平較高脂組明顯降低 (P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠骨骼肌TG、FFA、LCACoA比較 ()Tab.2 TG、FFA、LCACoA in skeletal muscle among groups()

表2 各組大鼠骨骼肌TG、FFA、LCACoA比較 ()Tab.2 TG、FFA、LCACoA in skeletal muscle among groups()

注:與高脂組比較，*P＜0.05;與正常組比較，#P＜0.05

組別TG/(mmol·g-1)FFA/(mmol·g-1)LCACoA/(nmol·g-1)正常組 0.07±0.01* 77.20±6.41* 3.82±0.26*高脂組 0.26±0.01# 150.06±6.36# 7.23±0.34#吡格列酮組 0.07±0.01* 64.80±6.16* 4.68±0.21*#津力達組 0.07±0.01* 79.59±6.62* 5.00±0.13*#

2.4 各組大鼠線粒體基因的表達 RT-PCR檢測了線粒體Pgc1α，核呼吸因子1(Nrf1)，細胞色素C氧化酶亞基Ⅳ (CoxⅣ)的表達，同時檢測了線粒體氧化脂肪酸基因包括肉堿脂酰轉移酶1(Cpt1)、乙酰輔酶A脫氫酶 (Acadm)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(Pparα)和Pparγ的表達。與正常組比較，高脂組上述基因mRNA的表達明顯下調 (P＜0.05)，津力達與吡格列酮均上調了Pgc1α、 Cpt1、 Acadm、 Pparα 及 Pparγ (P ＜0.05)，均未改變Nrf1的表達 (P＞0.05)。津力達上調了CoxⅣ的表達，而吡格列酮未能上調其表達。見表3。

表3 各組大鼠骨骼肌線粒體基因的比較 ()Tab.3 mRNA levels for multiple genes involved in mitochondrial function and fat oxidation in skeletal muscle among groups()

表3 各組大鼠骨骼肌線粒體基因的比較 ()Tab.3 mRNA levels for multiple genes involved in mitochondrial function and fat oxidation in skeletal muscle among groups()

注:與高脂組比較，*P＜0.05;與正常組比較，#P＜0.05

組別 Pgc1α Nrf1 CoxⅣ Cpt1 Acadm Pparα Pparγ正常組 1.32±0.08* 0.89±0.06* 1.35±0.09* 1.26±0.05* 1.67±0.19* 1.06±0.06* 1.59±0.08*高脂組 0.49±0.07# 0.47±0.04# 0.72±0.09# 0.49±0.05# 0.62±0.09# 0.39±0.04# 0.59±0.07#吡格列酮組 0.88±0.10*# 0.62±0.04# 0.75±0.06# 1.07±0.05*# 1.22±0.11*# 1.00±0.07* 1.47±0.07*津力達組 0.95±0.06*# 0.62±0.05# 1.12±0.12* 0.96±0.08*# 1.28±0.16*# 0.78±0.04*# 1.29±0.08*#

2.5 各組大鼠骨骼肌PGC-1α和CPT1蛋白表達大鼠骨骼肌組織PGC-1α和CPT1蛋白以其與β-actin的比值表示，結果顯示骨骼肌PGC-1α和CPT1蛋白高脂組低于正常組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，津力達及吡格列酮組較高脂組蛋白表達升高 (P＜0.05)。見圖1、表4。

表4 骨骼肌PGC-1α和CPT1蛋白相對表達量 ()Tab.4 Protein relative expression of PGC-1α and CPT1 in skeletal muscle()

表4 骨骼肌PGC-1α和CPT1蛋白相對表達量 ()Tab.4 Protein relative expression of PGC-1α and CPT1 in skeletal muscle()

注:與高脂組比較，*P＜0.05;與正常組比較，#P＜0.05

CPT1正常組 1* 1組別 PGC-1α*高脂組 0.46±0.05# 0.43±0.01#吡格列酮組 0.79±0.05*# 0.79±0.07*#津力達組 0.81±0.06*# 0.67±0.09*#

圖1 骨骼肌PGC-1α和CPT1蛋白表達比較Fig.1 Protein expression ofPGC-1α andCPT1in skeletal muscle

2.6 電鏡觀察 正常組大鼠骨骼肌組織線粒體、粗面內質網(wǎng)豐富，胞漿內無脂滴，線粒體膜、嵴結構完整，嵴為隔板狀，基質均勻，與線粒體長軸垂直，排列規(guī)則，粗面內質網(wǎng)排列整齊。高脂組大鼠骨骼肌組織脂滴較多，線粒體腫脹，線粒體嵴變少變短，部分或全部脊和膜融合消失，甚至出現(xiàn)空泡化，內質網(wǎng)擴張，津力達及吡格列酮干預后脂滴明顯減少，線粒體腫脹減輕。見圖2。

圖2 電鏡下線粒體形態(tài)觀察Fig.2 Mitochondria morphology was determined by electron microscopy

3 討論

胰島素抵抗 (IR)指外周組織及靶器官對胰島素的敏感性及反應性降低［1］，是肥胖和2型糖尿病的病理基礎。雖然引起IR的具體機制仍不明確，但是近年來人們認為脂質剩余可能是其分子基礎之一。

骨骼肌組織是全身脂肪酸利用的主要場所，骨骼肌IR的發(fā)生在整個機體IR中占重要地位。高脂飲食會誘導IR的發(fā)生，同時與細胞脂代謝異常密切相關，當脂肪酸的攝入超出骨骼肌自身氧化能力時通常會導致骨骼肌脂質堆積，如TG，F(xiàn)FA，LCACoA的堆積，從而損害胰島素信號傳導通路［4］，最終誘導骨骼肌乃至全身IR的發(fā)生。

線粒體是調控代謝的重要細胞器。線粒體內膜上有呼吸鏈酶系、ATP合成酶系及肉毒堿?；D移酶等，基質中則存在三羧酸循環(huán)酶類、脂肪酸氧化酶類和蛋白質、核酸合成酶類等，外膜中酶的量相對較少。線粒體主要功能是進行氧化磷酸化合成ATP，為細胞生命活動提供直接能量，同時也是糖脂代謝的場所。目前普遍認為機體的IR狀態(tài)與能量過度攝入，線粒體脂質代謝超負荷，導致線粒體功能障礙有關。當機體出現(xiàn)IR尤其是發(fā)生2型糖尿病時，線粒體功能往往已經(jīng)受損，因此通常出現(xiàn)線粒體脂肪酸氧化的減少及脂質異位積聚［5-6］。IR患者通常伴隨編碼線粒體蛋白的核基因表達下調，同時過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(Pgc1α)，調節(jié)線粒體生物合成及功能的關鍵核轉錄共激活因子，表達明顯下調［7］。其中線粒體內膜上的肉堿脂酰轉移酶1(CPT1)，將長鏈脂酰輔酶A轉運進入線粒體進行β氧化，是β氧化的限速環(huán)節(jié)，對骨骼肌乃至整個機體脂肪酸的氧化發(fā)揮重要作用。高脂飲食誘導的IR大鼠通常伴隨CPT1 的表達下調［8］。

津力達是由人參、黃精、蒼術 (炒)、苦參、麥冬、地黃等十幾味中藥制成，具有益氣養(yǎng)陰、健脾運津的功效。臨床試驗及動物實驗證實它能夠降低四氧嘧啶和腎上腺素所誘發(fā)大鼠的高血糖，調節(jié)糖耐量［9］，臨床上主要用于IR及糖尿病的治療，但是其具體作用機制尚不明確。本研究選用吡格列酮，PPARγ激動劑，作為陽性對照藥來探討津力達改善IR的作用機制。

津力達灌胃8周后明顯改善了高脂飲食誘導的大鼠IR:空腹血糖、胰島素、血TC、TG、FFA等均得到改善;高脂飲食后骨骼肌脂質 (TG、FFA、LCACoA)發(fā)生沉積，津力達及對照藥物吡格列酮干預后脂質沉積明顯減輕。為進一步探究其機制，本實驗檢測了津力達對骨骼肌線粒體基因Pgc1α、Nrf1、CoxⅣ 及線粒體氧化脂肪酸基因 Cpt1、Acadm、Pparα和Pparγ表達的影響，同時檢測了骨骼肌PGC-1α和CPT1蛋白的表達。高脂飲食后線粒體基因及PGC-1α、CPT1蛋白表達明顯下調，津力達干預后明顯增加了上述基因及蛋白的表達:表達上調的CPT1將LCACoA轉運進入線粒體，線粒體基因尤其是氧化脂肪酸基因表達的上調增加了線粒體氧化脂肪酸能力，從而對進入線粒體的脂質進行充分地β氧化，減少了骨骼肌脂質沉積，改善了IR。與津力達不同，吡格列酮未能上調CoxⅣ基因的表達。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食大鼠骨骼肌線粒體基因表達下調、功能減低，骨骼肌脂質TG、FFA、LCACoA水平增加，發(fā)生胰島素抵抗。津力達干預之后上調了骨骼肌線粒體基因的表達，增強了線粒體功能及脂肪酸β氧化，最終減少了骨骼肌脂質沉積，改善了胰島素抵抗。

［1］Sinaiko A R，Caprio S.Insulin resistance［J］.Pediatr，2012，161(1):11-15.

［2］Pedersen B K，F(xiàn)ebbraio M A.Muscles，exercise and obesity:skeletal muscle as a secretory organ ［J］.Nat Rev Endocrinol，2012，8(8):457-465.

［3］Giebelstein J，Poschmann G，Hojlund K，et al.The proteomic signature of insulin-resistant human skeletal muscle reveals increased glycolytic and decreased mitochondrial enzymes［J］.Diabetologia，2012，55(4):1114-1127.

［4］Eckardt K，Taube A，Eckel J.Obesity-associated insulin resistance in skeletal muscle:role of lipid accumulation and physical inactivity［J］.Rev Endocr Metab Disord，2011，12(3):163-172.

［5］鄒琪婧，曹仁賢，洪 濤.線粒體脂質過載與胰島素抵抗［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，28(6):880-882.

［6］趙 斐，靳慶勛，喬海榮，等.有氧運動改善高脂膳食誘導的胰島素抵抗:增強骨骼肌線粒體融合與分裂及功能［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2012，31(1):24-30.

［7］張 媛，漆正堂，郭 維，等.耐力訓練對高脂膳食大鼠骨骼肌線粒體脂肪氧化及 PGC-α基因表達的影響［J］.天津體育學院學報，2010，25(3):193-196.

［8］Zhang X，Wang C，Song G，et al.Mitofusion-2-mediated alleviation of insulin resistance in rats through reduction in lipid intermediate accumulation in skeletal muscle［J］.J Biomed Sci，2013，20(1):Epub ahead of print.

［9］洪曉華，李映歐，于魏林，等.津力達口服液對糖尿病大鼠肝細胞膜胰島素受體的影響［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，1997，17(S1):113-114.