龐曉斌，謝欣梅，，王保全，李曉婷

(1.河南大學(xué)藥物研究所，河南開封 475004;2.河南大學(xué)淮河臨床醫(yī)學(xué)院，河南開封 475001;3.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 475004)

血腦屏障 (blood-brain barrier)位于血液與中樞神經(jīng)系統(tǒng) (centralnervoussystem，CNS)的神經(jīng)組織之間，主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (Brainvaseularendothelialeell，BVEC)、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、基底膜構(gòu)成。血腦屏障的破壞可導(dǎo)致血管源性腦水腫，是腦缺血再灌注損傷后腦水腫的重要病理基礎(chǔ)［1-2］。

脈絡(luò)寧注射液源自著名醫(yī)方“四妙勇安湯”，由玄參、牛膝、石斛、金銀花等組成，化學(xué)成分包括香豆素類、苯丙素類、昆蟲變態(tài)激素、三萜皂苷等［3］，具有養(yǎng)陰清熱、活血化瘀的功效［4］。臨床上廣泛用于治療缺血性腦血管?。?］，療效可靠，副作用小。有研究表明脈絡(luò)寧注射液能明顯縮小大腦中動(dòng)脈阻斷 (middle cerebral artery occlusion，MCAO)后引起的腦梗死范圍，降低毛細(xì)血管通透性，減輕腦水腫等作用，但目前作用機(jī)制尚不明確［6-7］。

本實(shí)驗(yàn)采用MCAO栓線法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注 (ischemia/reperfusion，I/R)模型，通過觀察脈絡(luò)寧注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注后血腦屏障通透性及緊密連接相關(guān)蛋白緊密連接蛋白-1(zonular occludens protein-1，ZO-1)、閉合蛋白(occludin)表達(dá)的影響，探討其對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量280～300 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXY(京)2010-0009。實(shí)驗(yàn)過程中大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，室溫 (25±2)℃，相對(duì)濕度 (55±5)%，燈光控制12 h晝夜交替。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的所有操作均符合中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的要求。

1.2 藥物 脈絡(luò)寧注射液 (金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，批號(hào)20120654);依達(dá)拉奉注射液 (國(guó)藥集團(tuán)國(guó)瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)201110302)

1.3 試劑 氯化-2，3，5-三苯基四氮唑 (2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)，伊文思藍(lán) (Evans Blue，EB)購自Sigma公司;兔抗鼠ZO-1抗體、兔抗鼠occludin抗體購自Santa-Cruz公司;辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自美國(guó)Pierce Biotechnology公司;SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色劑購于武漢博士德生物技術(shù)研究所。

1.4 主要儀器 顯微鏡SZX16型(日本Olympus公司);冰凍切片機(jī) (萊卡，德國(guó));PowerGen 125型組織勻漿機(jī) (賽默飛世爾公司);GS-15R離心機(jī) (Beckinan公司，美國(guó))。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理 72只成年健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注模型組、伊達(dá)拉奉給藥組 (3 mg/kg)、脈絡(luò)寧高、中、低劑量組 (4、2、1 mL/kg)，每組12只。各組分別于再灌注即刻由尾靜脈注射給藥，假手術(shù)組與模型組分別給予2 mL生理鹽水。

2.2 大腦MCAO法建立大鼠腦缺血再灌注 (I/R)模型 SD大鼠術(shù)前12 h禁食，10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定。參照Longa等的大腦中動(dòng)脈線栓法，造成右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞［8］。缺血2 h后，將栓線向外拉出至頸內(nèi)實(shí)現(xiàn)再灌注。按照Longa等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，各組分別在再灌注24 h進(jìn)行評(píng)分:0分，正常，無神經(jīng)學(xué)征象;1分，動(dòng)物不能完全伸展右前肢;2分，動(dòng)物右側(cè)肢體癱瘓，行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象;3分，動(dòng)物行走向右側(cè)跌倒，或動(dòng)物不能站立或動(dòng)物打滾;4分，無自發(fā)活動(dòng)，有意識(shí)障礙。神經(jīng)功能評(píng)分在1～3分為模型成功。0分和4分為模型不成功予剔除，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充剔除出組的動(dòng)物，保證每組動(dòng)物數(shù)。假手術(shù)組只進(jìn)行術(shù)前麻醉和血管分離術(shù)，不結(jié)扎及導(dǎo)入線栓。

2.3 腦梗死體積的測(cè)定 各組取再灌注24 h后的大鼠3只，以10%水合氯醛(350 mg/kg體質(zhì)量)行腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，經(jīng)心臟灌流生理鹽水固定。斷頭取腦，迅速將取出的腦組織置于－20℃冰箱，10 min后置室溫環(huán)境，將腦從額極至枕葉連續(xù)冠狀切面，厚約2 mm，共5層。然后迅速將腦片置于5 mL含2%TTC的溶液中，37℃恒溫、避光孵育30 min，然后置于4%多聚甲醛溶液，4℃固定，數(shù)碼相機(jī)拍照，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)軟件處理計(jì)算腦梗死體積。經(jīng)TTC染色后，正常組織呈玫瑰紅色，梗死組織未被染色而呈白色。

2.4 血腦屏障通透性檢測(cè) 各組取大鼠3只，手術(shù)后 (給藥后)即刻由尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)(EB)2 mL。再灌注24 h后，快速打開胸腔并暴露心臟，從左心室灌注生理鹽水直至流出無色液體，斷頭取腦，小心剝?nèi)∮覀?cè)大腦半球，電子天平精確稱量其濕質(zhì)量后，加入甲酰胺，于45℃的水浴箱孵育24 h，3000 r/min離心15 min，取上清液，于620 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)EB溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算EB的水平 (μg/g腦質(zhì)量)。

2.5 Western blot檢測(cè)ZO-1、occludin的表達(dá) 動(dòng)物于再灌注24 h后，4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，冠狀切取前囪前1.0 mm至前囪后3.0 mm的腦組織，進(jìn)行勻漿;在冰上加蛋白裂解液裂解，然后在4℃下12000 r/min離心5 min，進(jìn)行蛋白水平的測(cè)定;SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜;ZO-1(1∶500稀釋)、occludin(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜;相應(yīng)二抗室溫孵育2 h;ECL發(fā)光，曝光，顯影，對(duì)膠片進(jìn)行掃描與拍照，采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯影條帶灰度值分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，所得結(jié)果以表示，組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上均數(shù)的比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 脈絡(luò)寧對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響 結(jié)果顯示，腦缺血2 h再灌注24 h后，假手術(shù)組無腦梗死出現(xiàn)，模型組的腦梗死明顯;與模型組相比，脈絡(luò)寧各劑量組腦梗死體積縮小明顯，差異顯著 (P＜0.05)。見圖1。

圖1 脈絡(luò)寧對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響 (，n=3)Fig.1 Effects of Mailuoning on brain infarct volume in I/R rats(，n=3)

3.2 脈絡(luò)寧對(duì)大鼠缺血再灌注腦組織血腦屏障通透性的影響 結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織EB水平明顯升高，差異顯著 (P＜0.01);與模型組相比，各用藥組大鼠腦組織EB水平明顯降低 (P＜0.01或 P＜0.05)，以脈絡(luò)寧高劑量組減低最為顯著 (P＜0.01)。見表1。

表1 脈絡(luò)寧對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織血腦屏障通透性的影響 (，n=3)Tab.1 Effects of Mailuoning on permeability of bloodbrain barrier in brain tissue of I/R rats(，n=3)

表1 脈絡(luò)寧對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織血腦屏障通透性的影響 (，n=3)Tab.1 Effects of Mailuoning on permeability of bloodbrain barrier in brain tissue of I/R rats(，n=3)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別 動(dòng)物/只 劑量 EB水平/(μg·g－1)5.85±0.28模型組 3 － 26.55±3.46＊＊依達(dá)拉奉 3 3 mg/kg 17.32 ±2.87＊▲脈絡(luò)寧組(高) 3 4 mg/kg 10.53±1.56＊▲▲脈絡(luò)寧組(中) 3 2 mg/kg 18.46 ±1.31＊▲脈絡(luò)寧組(低) 3 1 mg/kg 20.58±2.56假手術(shù)3－＊▲

3.3 脈絡(luò)寧對(duì)腦缺血再灌注大鼠ZO-1、occludin蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組腦組織中ZO-1和occludin的表達(dá)量明顯下降(P＜0.01)，表明緊密連接的破壞;與模型組相比，各給藥組ZO-1和occludin兩種蛋白的表達(dá)均明顯增加 (P＜0.01或P＜0.05)，以脈絡(luò)寧高劑量組降低最為顯著，顯示了脈絡(luò)寧對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的保護(hù)作用。見圖2。

4 討論

血腦屏障是維持腦內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定、保障大腦正常功能的重要生理屏障［1］。腦缺血后血腦屏障的損傷既是損傷結(jié)果，也是進(jìn)一步觸發(fā)損傷的原因，是腦缺血級(jí)聯(lián)損傷的重要病理過程。本實(shí)驗(yàn)采用依文思藍(lán)滲透法檢測(cè)通透性，結(jié)果顯示，模型組EB水平明顯增加，與假手術(shù)組比較有顯著差異，說明腦缺血再灌注可造成血腦屏障的損傷，使血腦屏障的通透性增加;與模型組比較脈絡(luò)寧各劑量組腦EB水平均有所降低，表明脈絡(luò)寧能有效降低腦缺血再灌注所致的血腦屏障通透性增加，對(duì)血腦屏障結(jié)構(gòu)有一定的保護(hù)作用。

圖2 脈絡(luò)寧對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織ZO-1、occludin蛋白表達(dá)的影響 (，n=3)Fig.2 Effects of Mailuoning on ZO-1，occludin proteins expression in brain tissue of I/R rats(，n=3)

血腦屏障主要包括3層結(jié)構(gòu):腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞終足。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接 (tightjunction)是細(xì)胞間的通透屏障，通過細(xì)胞旁路徑調(diào)控水、離子和大分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)［9］。緊密連接由ZO-1、occludin及細(xì)胞骨架蛋白等相連而成。ZO-1和occludin是內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白，ZO-1在緊密連接的組成中居于核心地位［10］。有多項(xiàng)研究表明，緊密連接蛋白表達(dá)量的改變，位置分布的變化或結(jié)構(gòu)功能的異常均可能破壞緊密連接的完整性，引起細(xì)胞間連接的開放，導(dǎo)致血腦屏障通透性的改變［11-12］。多項(xiàng)研究表明，急性腦缺血的情況下，血腦屏障的通透性增加，生理狀態(tài)下不能通透的物質(zhì)可以穿越血腦屏障，到達(dá)組織間隙［13-14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血再灌注24 h后模型組大鼠缺血區(qū)腦組織ZO-1和occludin蛋白表達(dá)明顯下降，說明血腦屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)破壞，導(dǎo)致血腦屏障通透性的改變，加重腦缺血再灌注損傷。脈絡(luò)寧能顯著提高ZO-1和occludin蛋白的表達(dá)，改善血腦屏障功能，起到腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，脈絡(luò)寧對(duì)腦缺血再灌注后血腦屏障的破壞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)ZO-1和occludin，修復(fù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接有關(guān)。

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