牛秉軒，司艷莉，詹合琴*，閆福林

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

缺血性腦血管疾病是臨床上的多發(fā)病和常見(jiàn)病，目前臨床對(duì)于缺血性腦血管疾病的治療主要是通過(guò)溶栓療法來(lái)恢復(fù)腦血流灌注，但再灌注會(huì)引起更大的損傷。高翅果菊Pterocypsela elata，菊科翅果菊屬植物，中國(guó)大陸很多省份均有分布，其中萵苣芮 B(lactuside B，3β-葡萄糖-14-羥基-11β，13-二氫木香烯內(nèi)酯)是本類(lèi)植物中的主要化學(xué)成分之一。本研究小組前期從高翅果菊中提取到的萵苣苷B具有明顯的抗腦缺血作用［1-2］，但國(guó)內(nèi)外對(duì)其作用機(jī)制研究相對(duì)較少。以往報(bào)道顯示，腦缺血再灌注損傷與Grp78(glucose regulated protein，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78)和Caspase-3的激活有關(guān)，上調(diào)Grp78 mRNA和下調(diào)Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平能有效地保護(hù)神經(jīng)元，那么萵苣苷B對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是否與Grp78 mRNA和Caspase-3 mRNA的表達(dá)有關(guān)是本研究擬探討的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料 Eppendorf AG PCR擴(kuò)增儀 (德國(guó)Eppendorf公司);DYY-7C型水平電泳儀 (北京市六一儀器廠(chǎng));TGL-16G-A臺(tái)式高速低溫離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));UV-2102PC紫外分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司);SANYO MDFU4086S超低溫冰箱 (日本 SANYO公司);TOCAN240凝膠成像系統(tǒng) (上海領(lǐng)成生物科技有限公司);萵苣苷B由藥物化學(xué)教研室閆福林教授提供，為白色粉末狀 (純度＞99.9%);陽(yáng)性對(duì)照藥尼莫地平注射液 (山東方明藥業(yè)股份有限公司，4 mg/20 mL，20 mL/支);DL2000DNA Marker(北京天根生化有限公司);Trizol(美國(guó)Invertrogen公司);loading buffer和RT-PCR試劑盒 (寶生物工程大連有限公司，TaKaRa Code:DRR014A)。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 1)選用清潔級(jí)SD(Sprague-Dawiey)雄性大鼠 (鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量260～300 g，動(dòng)物合格證號(hào) SYXK(豫)2005-0012)。2)大鼠腹腔注射 (大鼠腹腔注射量為0.5～1 mL/100 g)［3］，按0.5 mL/100 g計(jì)算，稱(chēng)取300 mg萵苣苷B溶入30 mL蒸餾水中，配成萵苣苷B高劑量組所用藥液 (50 mg/kg)，再抽取高劑量組液體10 mL對(duì)倍稀釋配成中劑量組所用藥液20 mL(25 mg/kg);最后再抽取中劑量組液體10 mL對(duì)倍稀釋配成低劑量組所用藥液(12.5 mg/kg)。3)隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組 (1 mg/kg)、萵苣苷B低劑量組 (12.5 mg/kg)、萵苣苷 B中劑量組 (25 mg/kg)、萵苣苷B高劑量組 (50 mg/kg)，8只/組。4)制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型。選用1.5號(hào)漁線(xiàn) (DaDong Yang生產(chǎn))制備阻塞線(xiàn)，每根剪成5～6 cm長(zhǎng)，將其一端用火燒成圓形，在1%的肝素溶液中浸泡備用。10%的水合氯醛麻醉動(dòng)物后，參照Longa［4］線(xiàn)栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型，每組動(dòng)物于再灌后按5 mL/kg腹腔注射給藥，2次/d。分別于缺血再灌注24 h和72 h后處死動(dòng)物，收取標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 RNA提取 1)提取組織在液氮中研磨，每100 mg組織加1 mL Trizol進(jìn)行勻漿處理。2)在裂解液中每1 mL Trizol加入0.2 mL三氯甲烷，劇烈震蕩幾秒后室溫放置10 min。3)5℃下12000×g離心20 min，取上清，每1 mL Trizol加入0.5 mL異丙醇，混勻后室溫下放置10 min。4)5℃下12000×g離心10 min，去上清，每1 mL Trizol加入1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，25℃干燥約5 min，溶于適量無(wú)RNase的水;紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度與純度，－70℃保存。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)Grp78、Caspase-3基因的轉(zhuǎn)錄水平 cDNA模板用TaKaRa pimeScript TM RT-PCR試劑盒合成，并進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:95℃ 5 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，引物見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。采用Quantity One圖像分析系統(tǒng)分析各個(gè)條帶的灰度值，以擴(kuò)增后的特異性目的片段灰度值與同時(shí)擴(kuò)增的β-actin片段灰度值相比，其比值作為特異性擴(kuò)增目的片段的半定量檢測(cè)值。每組每只動(dòng)物重復(fù)3次求其平均值。

表1 Grp78、Caspase-3和β-actin的上、下游引物Tab.1 Upstream and downstream primers sequence of Grp78，Caspase-3 and β-actin

2 結(jié)果

2.1 萵苣苷B對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后不同時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)Grp78 mRNA的影響 結(jié)果如表2和圖1所示:模型組動(dòng)物皮質(zhì)的Grp78 mRNA表達(dá)增多，與假手術(shù)組比較有顯著性差異 (P＜0.01);用藥后萵苣苷B各劑量組動(dòng)物皮質(zhì)的Grp78 mRNA表達(dá)明顯增多，與模型組和陽(yáng)性對(duì)照藥組比較均有顯著性差異 (P＜0.05，P＜0.01)，中劑量組作用較其他劑量組好;用萵苣苷B 72 h后Grp78 mRNA在皮質(zhì)的表達(dá)低于用藥24 h(P＜0.01)。

表2 萵苣苷B對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后皮質(zhì)Grp78 mRNA的影響 (，n=8)Tab.2 Effects of lactuside B on Grp78 mRNA for cerebral cortex after brain ischemia injury in rats(x ± s，n=8)

表2 萵苣苷B對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后皮質(zhì)Grp78 mRNA的影響 (，n=8)Tab.2 Effects of lactuside B on Grp78 mRNA for cerebral cortex after brain ischemia injury in rats(x ± s，n=8)

注:模型組與假手術(shù)組比較，*P＜0.01;用藥組與模型組比較，#P＜0.01;再灌72 h與24 h之間的比較，◇P＜0.01;萵苣苷B各劑量組與陽(yáng)性對(duì)照藥比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

72 h分組 劑量/(mg·kg －1)缺血再灌損傷24 h缺血再灌損傷假手術(shù)組0.16±0.01 0.15±0.00模型組 － 0.33±0.02* 0.18±0.01*陽(yáng)性對(duì)照組 1 0.60±0.02# 0.44±0.02#◇低劑量組 12.5 0.73 ±0.02#ΔΔ 0.54 ±0.02#Δ◇中劑量組 25 1.10 ±0.02#ΔΔ 0.61 ±0.02#ΔΔ◇高劑量組 50 0.63±0.00# 0.30±0.02#ΔΔ◇－

2.2 萵苣苷B對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后不同時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)Caspase-3 mRNA的影響 結(jié)果如表3和圖2所示:模型組動(dòng)物皮質(zhì)的Caspase-3 mRNA表達(dá)增多，與假手術(shù)組比較有顯著性差異 (P＜0.01);用藥后萵苣苷B各劑量組動(dòng)物皮質(zhì)的Caspase-3 mRNA表達(dá)明顯減少，與模型組和陽(yáng)性對(duì)照藥比較均有顯著性差異 (P＜0.05，P＜0.01)，但低劑量組的作用不如中高劑量組;用萵苣苷B 72 h后Caspase-3 mRNA在皮質(zhì)的表達(dá)低于用藥24 h(P＜0.01)。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是臨床上導(dǎo)致腦細(xì)胞凋亡的常見(jiàn)原因。細(xì)胞凋亡是基因嚴(yán)格調(diào)控而發(fā)生的自主性細(xì)胞有序死亡，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡主要和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線(xiàn)粒體凋亡途徑和膜死亡受體通路等有關(guān)。

圖1 萵苣苷B對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后皮質(zhì)Grp78 mRNA的影響 (，n=8)Fig.1 Effects of lactuside B on Grp78 mRNA for cerebral cortex after brain ischemia reperfusion injury in rats(，n=8)

表3 萵苣苷B對(duì)大鼠腦缺血損傷后皮質(zhì)Caspase-3 mRNA的影響 (，n=8)Tab.3 Effects of lactuside B on caspase-3 mRNA for cerebral cortex after brain ischemia injury in rats(，n=8)

表3 萵苣苷B對(duì)大鼠腦缺血損傷后皮質(zhì)Caspase-3 mRNA的影響 (，n=8)Tab.3 Effects of lactuside B on caspase-3 mRNA for cerebral cortex after brain ischemia injury in rats(，n=8)

注:模型組與假手術(shù)組比較，*P＜0.01;用藥組與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;萵苣苷B各劑量組與陽(yáng)性對(duì)照藥比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;再灌72 h與24 h之間的比較，◇P＜0.01

72 h假手術(shù)組分組 劑量/(mg·kg －1)缺血再灌損傷24 h缺血再灌損傷－ 0.17±0.01 0.18±0.00模型組 － 0.53±0.02* 0.56±0.02*陽(yáng)性對(duì)照組 1 0.46±0.02 0.30±0.01##◇低劑量組 12.5 0.42±0.01# 0.29±0.01##◇中劑量組 25 0.39±0.02##Δ 0.23±0.01##ΔΔ◇高劑量組 50 0.32±0.02##ΔΔ 0.20±0.02##ΔΔ◇

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein，Grp78)是熱休克蛋白70(Hsp70)的成員之一［5］，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的伴侶蛋白，它對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)有著重要的緩解作用，Grp78可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合，從而恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，維持細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［6］。有報(bào)道，腦缺血后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的經(jīng)典標(biāo)志物Grp78會(huì)大量的表達(dá)［7-8］。腦缺血損傷時(shí)，腦組織中的鈣失衡、缺氧和自由基增多等因素可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活未折疊蛋白反應(yīng)，未折疊蛋白反應(yīng)可使Grp78大量表達(dá)［9-10］。Grp78在腦缺血再灌注損傷后腦組織中的大量表達(dá)，不僅提示出缺血再灌注損傷可激活神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激狀態(tài)，也提示了Grp78可能在應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)受到損害的神經(jīng)細(xì)胞起著積極的保護(hù)作用。

圖2 萵苣苷B對(duì)腦缺血再灌注損傷大腦皮質(zhì)Caspase-3 mRNA的影響 (，n=8)Fig.2 Effects of lactuside B on Caspase-3 mRNA for cerebral cortex after brain ischemia reperfusion injury in rats(，n=8)

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)大鼠腦部行缺血再灌注術(shù)24 h后，模型組大鼠腦皮質(zhì)的Grp78 mRNA表達(dá)均成上升趨勢(shì)，但隨著時(shí)間的進(jìn)一步的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸減少，在再灌損傷72 h時(shí)Grp78 mRNA的表達(dá)均出現(xiàn)明顯的下降。正常神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Grp78與Caspase-7，12等蛋白形成大分子復(fù)合物，在缺血損傷時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生改變觸發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，該反應(yīng)激活一系列的生化反應(yīng)，Grp78因此從復(fù)合物中分離出來(lái)，游離量的增加使得膜蛋白激酶IRE1和PERK的活性增強(qiáng)，這些酶的活性增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定起到了一定的保護(hù)作用［11］。但過(guò)長(zhǎng)時(shí)間或是過(guò)大強(qiáng)度的應(yīng)激反應(yīng)反而使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定性減弱，Grp78的表達(dá)量減少，激活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，缺血損傷癥狀加重。換言之應(yīng)激反應(yīng)的過(guò)度表達(dá)可引起相關(guān)蛋白Grp78的表達(dá)減少。

研究結(jié)果顯示，給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射萵苣苷B 24 h和72 h后，大鼠皮質(zhì)的Grp78 mRNA表達(dá)均增加，中劑量組在24 h和72 h時(shí)間點(diǎn)的作用均明顯超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照藥組 (P＜0.01)，低、中、高劑量組在72 h的作用超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照藥組 (P＜0.05)，因此用藥72 h的作用優(yōu)于24 h且中劑量組優(yōu)于其他劑量組。但是萵苣苷B各劑量組對(duì)皮質(zhì)Grp78 mRNA表達(dá)的作用效果并非完全一致，不同劑量所產(chǎn)生的作用效果也不相同，該單體化合物的中、低劑量對(duì)大鼠皮質(zhì)抗腦缺血作用較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示出腦缺血損傷后Grp78 mRNA在動(dòng)物腦組織的高水平表達(dá)只能維持很短時(shí)間，不易對(duì)受損的神經(jīng)細(xì)胞起到長(zhǎng)時(shí)間的保護(hù)作用，而給予單體化合物萵苣苷B后，大鼠腦部不同部位的Grp78 mRNA表達(dá)均有延時(shí)性的增加，從而起到抗腦缺血損傷作用。以往研究顯示，Grp78在腦缺血損傷后的腦組織中表達(dá)增多，但同種動(dòng)物如新生鼠和成年鼠的鼠齡差異或在腦內(nèi)研究部位的差異其達(dá)峰時(shí)間有較大的不一致性［12-13］。一般情況下，Grp78在腦缺血損傷12 h后達(dá)到高峰，此后逐漸下降［14］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其報(bào)道的基本一致?？梢?jiàn)，短時(shí)的Grp78高表達(dá)能夠增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的保護(hù)作用，但這種保護(hù)作用十分有限，隨著腦缺血損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷程度加劇，Grp78表達(dá)降低，由此產(chǎn)生的保護(hù)作用減弱。本實(shí)驗(yàn)中，萵苣苷B可以使Grp78在腦缺血損傷后的皮質(zhì)中增加表達(dá)，且能維持一定的時(shí)間，提示了萵苣苷B能夠在一定時(shí)間內(nèi)保持腦組織中Grp78的表達(dá)處在一個(gè)較高的水平，這種持續(xù)性的高表達(dá)能夠調(diào)整腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，產(chǎn)生保護(hù)作用。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，參與細(xì)胞凋亡的多種通路中的線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C通路是其中的一條重要通路，而Caspase-3蛋白在該通路中起到樞紐的作用，是神經(jīng)細(xì)胞缺血損傷發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵蛋白［6，15］。對(duì)于缺血再灌注引起的刺激，神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，這些反應(yīng)通過(guò)信號(hào)系統(tǒng)傳遞給細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體，引起細(xì)胞色素C的釋放，細(xì)胞色素C與胞漿中的Apaf-1相互作用，又使得Caspase-9前體活化。多種影響因子的活化以及相互作用，激活了Caspase-3蛋白，最終引起了能夠使細(xì)胞死亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷后，模型組動(dòng)物皮質(zhì)的Caspase-3 mRNA表達(dá)均增加，說(shuō)明損傷引發(fā)了Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞凋亡增加。動(dòng)物腹腔注射萵苣苷B 24 h和72 h后，大鼠皮質(zhì)的Caspase-3 mRNA表達(dá)均降低，各劑量組作用超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照藥，尤其以中、高劑量組作用較好，且用藥72 h的作用優(yōu)于24 h。萵苣苷B各劑量組作用的差異性可能是由于藥物劑量設(shè)置不夠適當(dāng)所致。萵苣苷B可以抑制腦缺血再灌注引起的Caspase-3 mRNA的表達(dá)降低。進(jìn)一步可以說(shuō)明萵苣苷B通過(guò)抑制腦缺血再灌注損傷引起的腦細(xì)胞線(xiàn)粒體凋亡途徑來(lái)發(fā)揮大腦保護(hù)作用。

腦缺血再灌注損傷后，大腦皮質(zhì)細(xì)胞死亡不僅影響患者的神經(jīng)功能，甚至還能威脅患者的生命。以往的研究表明，小鼠和人類(lèi)細(xì)胞死亡過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線(xiàn)粒體凋亡有協(xié)同作用［16-17］，Rizzuto等［18］報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線(xiàn)粒體之間存在很多緊密聯(lián)系，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)InsP3/Ca2+通道的開(kāi)放影響線(xiàn)粒體鈣離子的平衡，InsP3/Ca2+通道又是Caspase-3的作用靶標(biāo)之一。在大腦缺血再灌注損傷中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度應(yīng)激也可能涉及與線(xiàn)粒體及細(xì)胞色素C的協(xié)同作用，從而引發(fā)Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。萵苣苷B對(duì)腦缺血損傷后不同時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)Grp78 mRNA和Caspase-3 mRNA表達(dá)改變的結(jié)果，進(jìn)一步說(shuō)明萵苣苷B可以抑制腦缺血-再灌注引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及線(xiàn)粒體凋亡。這對(duì)于將萵苣苷B作為一種抗腦缺血再灌注損傷的臨床治療藥物進(jìn)行研發(fā)有著理論支持和積極意義。

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