萬慧芳，余 波，涂 碩，余樂涵，萬福生(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330006)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在世 界上被列為第三大惡性腫瘤。在我國，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變、環(huán)境污染的加重，結(jié)直腸癌的發(fā)病率與死亡率均有呈逐年上升趨勢。中藥在腫瘤的治療方面有其獨(dú)特的療效，且副作用小，深受廣大腫瘤患者的好評。川芎嗪 (tetramethylpyraxine)是活血化瘀中藥川芎中的一種生物堿，具有擴(kuò)張血管、抗氧化及改善微循環(huán)等藥理作用，在臨床上的應(yīng)用范圍較廣［1-3］。近年研究發(fā)現(xiàn)［4-9］，川芎嗪具有抗腫瘤，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及提高藥物敏感性等作用，但其作用機(jī)制尚未闡明。p53正向凋亡調(diào)節(jié)因子 (p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)在藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，它是否參與川芎嗪抗結(jié)腸癌的作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察川芎嗪對人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其初步機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑和抗體 人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo(p53+/+)和正常人胚腎細(xì)胞293T均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。川芎嗪注射液為山東濰坊制藥有限公司 (批號120514)產(chǎn)品，DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Dulbecco)培養(yǎng)基以及胎牛血清均購于GIBCO公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Fermentas公司，GAPDH多抗 (TA-08)、Bcl-2單抗 (sc-783)和Bax單抗 (sc-526)均購于Santa Cruz公司，p53正向凋亡調(diào)節(jié)因子 (PUMA)多抗 (#Q9 BXH1)購于Cell Signaling Technology公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠 IgG(ZDR-5307)和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(ZDR-5306)購于北京中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞及藥物處理 LoVo細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。依據(jù)本研究室以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［1-3］，本研究采用0.25～4.0 mg/mL梯度的川芎嗪分別作用24 h、48 h和72 h處理LoVo細(xì)胞。又依據(jù)MTT結(jié)果(作用24 h、48 h及72 h的結(jié)果未見顯著性差異，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅選擇作用48 h)，選用1.0、2.0、4.0 mg/mL質(zhì)量濃度的川芎嗪分別作用LoVo細(xì)胞48 h，并觀察川芎嗪對細(xì)胞凋亡率、PUMA、Bax、及Bcl-2基因表達(dá)的影響。

1.3 MTT比色法檢測細(xì)胞存活率 將對數(shù)期生長的細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，使細(xì)胞密度至5000～8000個(gè)/孔，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。次日，加入不同質(zhì)量濃度川芎嗪藥物，川芎嗪組質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL，作用時(shí)間分別24、48、72 h，對照組加等體積培養(yǎng)基。然后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止。用150 μL DMSO充分溶解結(jié)晶。酶標(biāo)儀上在490 nm波長處檢測各孔的OD值，并計(jì)算抑制率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞凋亡率 收集對照組及經(jīng)藥物處理48 h后的各組細(xì)胞，加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞。然后，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后再加5 μL Propidium Iodide，混勻。室溫避光反應(yīng)5～15 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 RT-PCR檢測腫瘤細(xì)胞PUMA及Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá) 按照Invitrogen/TRIzol試劑盒說明進(jìn)行操作，先提取總RNA，并按Fermentas試劑盒說明制備 cDNA，然后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，最后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用凝膠成像系統(tǒng)拍照，Launch SensiAnsys凝膠分析系統(tǒng)軟件分析，以GAPDH條帶為參照，計(jì)算并比較各組目的基因的相對表達(dá)量。

1.6 Western blot檢測PUMA及Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞和提取蛋白，沸水浴使之變性，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 (SDSPAGE)電泳，每孔加樣量總蛋白量為30 μg。隨后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。然后將膜與 PUMA，Bax，Bcl-2(1∶200)抗體反應(yīng)，4℃過夜后，加入辣根過氧化物酶連接的二抗 (1∶2000)反應(yīng)約1.5 h，最后在暗室內(nèi)進(jìn)行檢測。用Image-Pro Plus 6.0凝膠圖像分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值掃描，以GAPDH為對照進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖的影響 用0.25～4.0 mg/mL梯度的川芎嗪處理LoVo細(xì)胞，觀察了川芎嗪對LoVo細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，隨著川芎嗪質(zhì)量濃度和作用時(shí)間的增加，川芎嗪對LoVo細(xì)胞的增殖抑制作用也逐漸加強(qiáng) (見表1)。在川芎嗪為1.0、2.0、4.0 mg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)上作用24 h、48 h及48 h的結(jié)果與正常對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，而各質(zhì)量濃度川芎嗪對正常293T細(xì)胞的生長并沒有顯著性影響 (見表2)。

表1 川芎嗪對人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖的影響 (，n=3)Tab.1 Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation in human colon cancer LoVo cells(，n=3)

表1 川芎嗪對人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖的影響 (，n=3)Tab.1 Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation in human colon cancer LoVo cells(，n=3)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

24 h 48 h 72 h川芎嗪0 mg/mL組組別 OD 1.43±0.05 1.51±0.05 1.63±0.05川芎嗪0.25 mg/mL組 1.38±0.05 1.49±0.04 1.59±0.05川芎嗪0.5 mg/mL組 1.34±0.05 1.46±0.04 1.57±0.05川芎嗪1.0 mg/mL組 1.29±0.05*1.42±0.04* 1.47±0.04*川芎嗪2.0 mg/mL組 1.28±0.04*1.37±0.05* 1.43±0.06*川芎嗪 4.0 mg/mL組 1.25±0.04＊＊0.96±0.05＊＊1.19±0.04＊＊

表2 川芎嗪對人正常293T細(xì)胞增殖的影響 (，n=3)Tab.2 Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation in human 293T cells(，n=3)

表2 川芎嗪對人正常293T細(xì)胞增殖的影響 (，n=3)Tab.2 Effect of tetramethylpyrazine on the proliferation in human 293T cells(，n=3)

注:與對照組比較，*P＜0.05

24 h 48 h 72 h川芎嗪0 mg/mL組組別 OD 1.42±0.06 1.47±0.04 1.50±0.056川芎嗪0.25 mg/mL組 1.41±0.06 1.45±0.04 1.49±0.063川芎嗪0.5 mg/mL組 1.41±0.06 1.46±0.06 1.46±0.042川芎嗪1.0 mg/mL組 1.41±0.05 1.45±0.08 1.47±0.021川芎嗪2.0 mg/mL組 1.38±0.07 1.39±0.07 1.45±0.052川芎嗪4.0 mg/mL組 1.28±0.05*1.43±0.07 1.46±0.018*

2.2 川芎嗪對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡的影響 用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn) (圖1)，與對照組 (凋亡率9.98%)比較，用1.0、2.0、4.0 mg/mL 3個(gè)不同質(zhì)量濃度的川芎嗪處理LoVo細(xì)胞48 h后，其細(xì)胞凋亡率分別為32.32%、41.51%和49.94%，提示川芎嗪處理組細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性增加 (P＜0.01)。

圖1 川芎嗪誘導(dǎo)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡Fig.1 Tetramethylpyrazine induces apoptosis in human colon cancer LoVo cells

2.3 川芎嗪對LoVo細(xì)胞中PUMA/Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 由圖2(RT-PCR檢測)結(jié)果表明，隨著川芎嗪質(zhì)量濃度的增加，LoVo細(xì)胞的PUMA mRNA表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)也出現(xiàn)上調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)則呈現(xiàn)下調(diào)，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。

圖2 人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中PUMA/Bax/Bcl-2的mRNA表達(dá)變化Fig.2 Changes of the expresion levels of PUMA/Bax/Bcl-2 mRNAs in human colon cancer LoVo cells

2.4 LoVo細(xì)胞中PUMA/Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平 圖3的Western Blot結(jié)果顯示:隨著川芎嗪質(zhì)量濃度的增加，人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中PUMA蛋白表達(dá)呈明顯上調(diào)，促凋亡蛋白Bax蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)卻出現(xiàn)明顯的下調(diào)，與對照組相比均有顯著性差異 (P＜0.05或P ＜0.01)。

3 討論

結(jié)直腸癌通常由良性腺瘤逐步緩慢演變?yōu)閻盒韵侔┥踔吝h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此，篩查與早期診斷是防治結(jié)直腸癌的最佳手段。據(jù)流行病學(xué)資料顯示，我國已進(jìn)入結(jié)腸癌高發(fā)區(qū)的行列。因此，我國對結(jié)腸癌防治研究的形勢緊迫，探討結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，特別是從基因和人們的生活習(xí)慣兩個(gè)方面研究結(jié)直腸癌的發(fā)生的分子機(jī)制，對結(jié)直腸癌的防治將具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

圖3 人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中PUMA/Bax/Bcl-2蛋白的表達(dá)變化Fig.3 Changes of the expresion levels of PUMA/Bax/Bcl-2 proteins in human colon cancer LoVo cells

近年來報(bào)道川芎嗪具有抑制白血?。?0］、乳腺癌［11］、宮頸癌［12］、前列腺癌［4］等多種惡性腫瘤的作用，川芎嗪的抗腫瘤作用日益受到人們重視，但它對結(jié)直腸癌的防治作用鮮見報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到不同質(zhì)量濃度的鹽酸川芎嗪能有效地抑制Lo-Vo細(xì)胞增殖，增加其凋亡，且作用具有明顯時(shí)間和劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞凋亡方向探討了川芎嗪的抗結(jié)直腸癌作用。結(jié)果證實(shí):川芎嗪可以抑制人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖，并可促進(jìn)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡。以 PUMA、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)為代表，從線粒體凋亡途徑探討了川芎嗪誘導(dǎo)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，結(jié)果提示川芎嗪可通過上調(diào)PUMA蛋白表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)Bax蛋白和下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，激活Caspase-3，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，為川芎嗪用于防治人結(jié)腸癌提供了新的分子基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)于川芎嗪抗腫瘤作用的分子機(jī)制，目前各種報(bào)道不一。有研究認(rèn)為川芎嗪能下調(diào)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移［13］;也有人認(rèn)為川芎嗪能降低腫瘤細(xì)胞DNA的合成，從而抑制細(xì)胞有絲分裂［14］，增強(qiáng)促凋亡基因的表達(dá)、抑制某些抗凋亡基因的表達(dá)。近期有研究發(fā)現(xiàn)AKT及其下游信號通路介導(dǎo)了川芎嗪抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖與促凋亡作用［4］，即川芎嗪可通過抑制AKT蛋白表達(dá)及活性，繼而抑制細(xì)胞增殖，啟動細(xì)胞凋亡，最終達(dá)到抑制前列腺癌PC3細(xì)胞生長的目標(biāo)。

在中藥日益受到人們青睞的今天，已發(fā)現(xiàn)許多中藥有較好的抗腫瘤作用，其促凋亡的作用還與PUMA的表達(dá)密切相關(guān)［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，川芎嗪可通過上調(diào)PUMA蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Wang等［15］用綠茶多酚處理腸癌細(xì)胞LoVo后，發(fā)現(xiàn)了同樣的作用。類似的報(bào)道還有大蒜素誘導(dǎo)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡時(shí)PUMA表達(dá)增加，抑制PUMA表達(dá)，則大蒜素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用明顯下降。次黃芩素作用于前列腺癌細(xì)胞LNCaP后，其胞內(nèi)PUMA蛋白表達(dá)也增加，細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放增多，Caspases級聯(lián)反應(yīng)被激活［16］。

Bcl-2蛋白是在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵性作用的一類蛋白質(zhì)。在線粒體膜上，Bcl-2家族蛋白通過與其他凋亡蛋白的協(xié)同作用，調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，發(fā)揮著細(xì)胞凋亡“主開關(guān)”的作用，Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等，Bax蛋白在正常細(xì)胞中存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到死亡信號刺激后，促凋亡蛋白產(chǎn)生增多，Bax與BID或BIM相互作用后形成插入線粒體膜的蛋白孔道，導(dǎo)致線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì)，在ATP或dATP作用下，與凋亡水解蛋白酶激活因子Apaf-1及胱天蛋白酶-9共同組成凋亡體，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［17］。因此，Bcl-2家族促抗凋亡蛋白的平衡決定了細(xì)胞是否凋亡的命運(yùn)，通過調(diào)節(jié)抗凋亡與促凋亡蛋白的平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活。

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