何梅鳳，吳 偉，鄧新國(guó)

(中山大學(xué)中山眼科中心，廣東廣州 510060)

羥基紅花黃色素A具有抗凝、抗缺氧、降血壓、改善心腦血管供血不足等作用，臨床可用于防治心肌缺血、腦缺血、冠心病、腦血栓等疾?。?-3］。近年來(lái)隨著對(duì)羥基紅花黃色素A藥理作用機(jī)理研究的日益深入，在眼科方面也取得一定進(jìn)展，羥基紅花黃色素A可在體外保護(hù)晶狀體免受氧化損傷，阻止脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程和白內(nèi)障的形成［4］;在高糖下如糖尿病視網(wǎng)膜病變中可能抑制新生血管的生成，有望成為糖尿病視網(wǎng)膜病變的有效治療藥物［5］，顯示出其在眼科疾病的治療有很好的應(yīng)用前景。目前，關(guān)于羥基紅花黃色素A在體內(nèi)定性、定量測(cè)定的分析方法已有報(bào)道［6］，但以血樣中的量測(cè)定為主，全身用藥在眼房水中的吸收情況尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用紅花黃色素A兔靜脈注射并測(cè)定了房水中藥物濃度，為其在眼科的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀及其化學(xué)工作站(美國(guó)Agilent公司);TGL－16G臺(tái)式離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠);SK-1型快速混勻器 (江蘇金壇醫(yī)療儀器廠);電子分析天平 (德國(guó)Sartorius公司)。

1.2 藥品與試劑 羥基紅花黃色素A對(duì)照品 (中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111637-201106，純度92.5%);注射用紅花黃色素 (浙江永寧藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)110610);乙腈、甲醇為色譜純;磷酸為分析純;水為注射用水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭兔由廣州市花都區(qū)花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液的配制 取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，精密稱定，加25%甲醇溶解并稀釋至每1 mL含5.60 μg的溶液，即得。

2.2 給藥及樣品采樣 取3只新西蘭兔，靜脈注射紅花黃色素10 mg/kg，30 min后，采取耳緣靜脈空氣栓塞處死兔，取房水置－20℃冰箱備用。

2.3 房水樣品的處理 分別取兔房水0.2 mL，各加6%高氯酸0.2 mL，漩渦振蕩混勻1 min，10000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣測(cè)定。

2.4 色譜條件及方法的專屬性考察 色譜柱為Diamonsil C18柱;流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液 (26∶2∶72);體積流量為0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為403 nm;柱溫為50℃;進(jìn)樣量20 μL。在上述色譜條件下，分別取空白房水樣品、羥基紅花黃色素A對(duì)照溶液以及房水樣品進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，羥基紅花黃色素A的保留時(shí)間約為11 min，峰尖而對(duì)稱，無(wú)其他峰干擾，表明該方法可行。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 線性范圍 分別精密量取對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，分別取溶液20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積。將峰面積 (A)與質(zhì)量濃度 (C)做線性回歸，得羥基紅花黃色素A的線性回歸方程為:A=69.1588 C–0.6947，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A在0.28～4.48 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 回收率試驗(yàn) 取兔空白房水，分別精密加入羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液和甲醇，配制高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的羥基紅花黃色素A房水液，按“樣品處理”項(xiàng)下操作并進(jìn)行分析，求得羥基紅花黃色素A在空白房水中的回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

2.7 精密度試驗(yàn) 取高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的羥基紅花黃色素A房水液，于日內(nèi)的不同時(shí)間和不同的日間分別進(jìn)樣5次，考察日內(nèi)與日間的精密度，結(jié)果日內(nèi)精密度為3.85%、3.48%、5.04%，日間精密度為5.13%、4.26%、5.61%(n=5)。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)［7-8］取高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的羥基紅花黃色素A房水液，于室溫放置0、6、12 h及在－20℃冷凍保存3 d后，分別經(jīng)樣品處理并測(cè)定羥基紅花黃色素A的質(zhì)量濃度，結(jié)果表明具有良好的穩(wěn)定性，RSD＜6.5%。

2.9 樣品測(cè)定 取靜脈注射紅花黃色素30 min后的兔眼房水樣品 (6只眼)，按“2.3”項(xiàng)處理，測(cè)定羥基紅花黃色素A在房水中的濃度，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 房水中羥基紅花黃色素A測(cè)定結(jié)果 (n=6，)

表2 房水中羥基紅花黃色素A測(cè)定結(jié)果 (n=6，)

樣品號(hào) 羥基紅花黃色素A/(μg·mL－1) 平均/(μg·mL－1)12.5822.2532.1142.1752.7162.822.44±0.3

3 討論

紅花黃色素為紅花中多種水溶性查爾酮成分的混合物，而羥基紅花黃色素A是其混合物中主要的有效成分，因此，羥基紅花黃色素A常作為應(yīng)用紅花黃色素后在體內(nèi)某組織的濃度的考察指標(biāo)。目前，羥基紅花黃色素A的測(cè)定多采用高效液相色譜法［9-14］，但色譜條件及樣本處理方法各有不同，主要采用甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液，乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液，乙腈-甲醇-水，甲醇-乙腈-1.2% 磷酸二氫鉀溶液以及甲醇-水-冰醋酸等不同的配比作為流動(dòng)相，而樣品處理多采用高氯酸，也有采用乙腈和甲醇處理生物樣本后對(duì)羥基紅花黃色素A進(jìn)行測(cè)定。

本研究參照《中國(guó)藥典》項(xiàng)下的流動(dòng)相組成［15］，并對(duì)柱溫和體積流量加以優(yōu)化，選用高氯酸沉淀房水中的微量蛋白，甲醇－乙腈－0.7%磷酸溶液 (26∶2∶72)為流動(dòng)相，在波長(zhǎng)為403 nm下對(duì)兔靜脈注射房水中的羥基紅花黃色素A質(zhì)量濃度進(jìn)行了測(cè)定，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，本方法具有準(zhǔn)確、可靠、快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于對(duì)房水羥基紅花黃色素A的測(cè)定。研究結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A通過(guò)靜脈注射能透過(guò)血眼屏障，進(jìn)入房水，這一結(jié)果為其全身用藥治療眼部疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)將進(jìn)一步研究羥基紅花黃色素A在房水中的藥動(dòng)學(xué)行為，為臨床合理用藥提供參考。

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