謝 婷

(常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇常州 213000)

復(fù)方香薷水為中藥復(fù)方制劑，處方源于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二十冊(cè)，由皺葉香薷、木香、紫蘇葉、歪葉藍(lán)、廣藿香、厚樸、豆蔻、生姜、甘草等九味藥物組成。具有解表化濕、醒脾和胃之功效、可用于外感風(fēng)寒、內(nèi)傷暑濕、寒熱頭痛、脘腹痞滿(mǎn)脹痛、惡心欲吐、腸鳴腹瀉等癥的治療［1-2］。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)方中木香和厚樸進(jìn)行了顯微鑒別控制，未對(duì)方中的任何藥味進(jìn)行成分定量測(cè)定。皺葉香薷、木香和紫蘇葉為方中主要藥物，皺葉香薷具有發(fā)汗解表、化濕和中的功效，可用于暑濕感冒、惡寒發(fā)熱、頭痛無(wú)汗、腹痛吐瀉、水腫、小便不利等癥的治療;木香具有行氣止痛、健脾消食的功效，可用于胸脅、脘腹脹痛、瀉痢后重、食積不消、不思飲食等癥的治療;紫蘇葉具有解表散寒、行氣和胃的功效，可用于風(fēng)寒感冒、咳嗽嘔惡、妊娠嘔吐、魚(yú)鱉中毒等癥的治療。同時(shí)麝香草酚和香荊芥酚為皺葉香薷主要成分，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯為木香主要成分，迷迭香酸為紫蘇葉主要成分。為保證產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床療效，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)皺葉香薷中麝香草酚、香荊芥酚和木香中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯以及紫蘇葉中的迷迭香酸進(jìn)行定量測(cè)定方法研究，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

高效液相色譜儀 (日本島津LC-10ATVP型，島津自動(dòng)進(jìn)樣器SIL-10ADVP);ANASTAR色譜數(shù)據(jù)工作站;紫外可見(jiàn)檢測(cè)器 (SPD-1OAVP);麝香草酚 (批號(hào) 100508-200902)、香荊芥酚 (批號(hào)111691-200602)、木香烴內(nèi)酯 (批號(hào) 111524-201107)、去氫木香內(nèi)酯 (批號(hào)111525-201008)和迷迭香酸 (批號(hào)111871-201102)對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;復(fù)方香薷水 (每瓶裝10 mL;批號(hào)為130407，130415，130423)購(gòu)于廣州一品紅制藥有限公司;甲醇、乙腈 (色譜純，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司);冰乙酸 (色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);磷酸 (分析純，廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 麝香草酚和香荊芥酚的定量分析［3-12］

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 Hypersil C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-2%冰醋酸溶液 (65∶35)，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm;體積流量為1.0 mL/min。在此條件下麝香草酚和香荊芥酚與其他組分分離效果良好，以麝香草酚計(jì)理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3000。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別取麝香草酚對(duì)照品和香荊芥酚對(duì)照品適量，加65%甲醇溶解制成每1 mL含0.05 mg的溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果麝香草酚對(duì)照品和香荊芥酚對(duì)照品均在275 nm處有最大吸收，故將檢測(cè)波長(zhǎng)定為275 nm。

2.1.3 對(duì)照品混合溶液的制備 精密稱(chēng)取麝香草酚對(duì)照品和香荊芥酚對(duì)照品各適量，加65%甲醇制成對(duì)照品混合溶液 (麝香草酚為0.0358 mg/mL，香荊芥酚為0.0712 mg/mL)。

2.1.4 供試品溶液的配制 取本品適量，精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，加65%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.5 陰性對(duì)照溶液的配制 按復(fù)方香薷水處方比例稱(chēng)取適量除皺葉香薷的其余藥味，按復(fù)方香薷水的前處理和制劑生產(chǎn)工藝制成缺皺葉香薷的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺皺葉香薷的陰性對(duì)照溶液。

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品混合溶液1、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，麝香草酚、香荊芥酚量為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。麝香草酚Y=4.0246×106X－864.2，r=0.9994;香荊芥酚Y=5.6472×106X+1022.4，r=0.9992。結(jié)果表明麝香草酚在0.0358～0.716 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好;香荊芥酚在0.0712～1.424 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.7 陰性對(duì)照試驗(yàn) 分別精密吸取10 μL的供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液，按“2.1.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行色譜分析，結(jié)果供試品溶液色譜中，在與麝香草酚對(duì)照品和香荊芥酚對(duì)照品相同保留時(shí)間處有吸收峰，而陰性對(duì)照溶液在相同保留時(shí)間處未顯吸收峰，見(jiàn)圖1。

2.1.8 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品混合溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.1.1”項(xiàng)的色譜條件測(cè)定麝香草酚和香荊芥酚的峰面積，結(jié)果表明，儀器具有良好的精密度，麝香草酚和香荊芥酚的RSD分別為0.57%、0.93%。

圖1 麝香草酚和香荊芥酚的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of thymol and carvacrol

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按上述方法制備6份供試品溶液，分別測(cè)定，麝香草酚和香荊芥酚的RSD分別為0.64%、0.88%。結(jié)果表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.1.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在放置0、1、2、4、6、8 h后精密吸取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積值，麝香草酚和香荊芥酚的RSD分別為0.59%、0.47%，供試品溶液8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量 (麝香草酚0.91 mg/mL、香荊芥酚1.70 mg/mL)的同一批樣品適量，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，分別精密加入對(duì)照品混合溶液25 mL，加65%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為加樣供試液。精密吸取加樣供試液10 μL，按上述測(cè)定方法測(cè)定其峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果表明本方法回收率良好，見(jiàn)表1。

表1 麝香草酚和香荊芥酚回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests for thymol and carvacrol

2.2 木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的定量分析［13-21］2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 Hypersil C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.4%磷酸溶液，梯度洗脫 (0～26 min，35.0%A;26～39 min，35.0%→52.0%A;39～55 min，52.0%A);體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm。在此條件下木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯與其他組分基線分離良好，以木香烴內(nèi)酯計(jì)理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3000。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別取木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解制成每1 mL含0.10 mg的溶液，按紫外-可見(jiàn)分光光度法在200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品均在227 nm處有最大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)定為227 nm。

2.2.3 對(duì)照品混合溶液的制備 精密稱(chēng)取木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品適量，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解后稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品混合溶液 (木香烴內(nèi)酯為0.0322 mg/mL和去氫木香內(nèi)酯0.0752 mg/mL)。

2.2.4 供試品溶液的制備 取本品適量，精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.5 陰性對(duì)照溶液的制備 按復(fù)方香薷水處方比例稱(chēng)取適量除木香的其余藥味，按復(fù)方香薷水的前處理和制劑生產(chǎn)工藝制成缺木香的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺木香的陰性對(duì)照溶液。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品混合溶液1、5、10、15、20 μL，按 “2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行梯度洗脫，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯量為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，木香烴內(nèi)酯回歸方程為Y=2.5384×106X－614.1，r=0.9995;去氫木香內(nèi)酯為Y=4.1267×106X+862.6，r=0.9993。結(jié)果表明木香烴內(nèi)酯在0.0322～0.6440 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好;去氫木香內(nèi)酯在0.0752～1.5040 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.7 陰性對(duì)照試驗(yàn) 分別精密吸取10 μL的供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液，按“2.2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行色譜分析，結(jié)果供試品溶液色譜中，在與木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品相同保留時(shí)間處有吸收峰，而陰性對(duì)照溶液在相同保留時(shí)間處未顯吸收峰，見(jiàn)圖2。

圖2 木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of costunolide and dehydrocostuslactone

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在放置0、1、2、4、6、8 h后精密吸取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積值，RSD分別為0.77%(木香烴內(nèi)酯)、0.38%(去氫木香內(nèi)酯)。結(jié)果表明，供試品溶液8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品混合溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.2.1”項(xiàng)的色譜條件測(cè)定木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的峰面積，結(jié)果表明，儀器具有良好的精密度，RSD分別為0.61%(木香烴內(nèi)酯)、0.92%(去氫木香內(nèi)酯)。

2.2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按上述方法制備6份供試品溶液，分別測(cè)定，RSD分別為0.64%(木香烴內(nèi)酯)、0.81%(去氫木香內(nèi)酯)。結(jié)果表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量 (木香烴內(nèi)酯0.82 mg/mL、去氫木香內(nèi)酯1.96 mg/mL)的同一批樣品適量，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，分別精密加入對(duì)照品混合溶液25 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為加樣供試液。精密吸取加樣供試液10 μL，按上述測(cè)定方法測(cè)定其峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果表明本方法回收率良好，見(jiàn)表2。

表2 木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests for costunolide and dehydrocostuslactone

2.3 迷迭香酸的測(cè)定［22-24］

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 Hypersil C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);甲醇-0.5%磷酸水溶液 (35∶65)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，體積流量為1.0 mL/min。在此條件下迷迭香酸與其他組分分離效果良好，以迷迭香酸計(jì)理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3000。

2.3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取迷迭香酸對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解制成每1 mL含0.05 mg的溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果迷迭香酸對(duì)照品在331 nm處有最大吸收，參考《中國(guó)藥典》2010年版一部紫蘇子藥材含量測(cè)定項(xiàng)下檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，故將檢測(cè)波長(zhǎng)定為330 nm。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取迷迭香酸對(duì)照品適量，加甲醇制成含迷迭香酸0.0486 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.4 供試品溶液的配制 取本品適量，精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.5 陰性對(duì)照溶液的配制 按復(fù)方香薷水處方比例稱(chēng)取適量除紫蘇葉的其余藥味，按復(fù)方香薷水的前處理和制劑生產(chǎn)工藝制成缺紫蘇葉的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺紫蘇葉的陰性對(duì)照溶液。

2.3.6 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，迷迭香酸量為橫坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=3.2457×106X－651.4，r=0.9994。結(jié)果表明迷迭香酸在0.0486～0.9720 μg進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.7 陰性對(duì)照試驗(yàn) 分別精密吸取10 μL的供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液，按“2.3.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行色譜分析，結(jié)果供試品溶液色譜中，在與迷迭香酸對(duì)照品相同保留時(shí)間處有吸收峰，而陰性對(duì)照溶液在相同保留時(shí)間處未顯吸收峰，見(jiàn)圖3。

2.3.8 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.3.1”項(xiàng)的色譜條件測(cè)定迷迭香酸的峰面積，結(jié)果表明，儀器具有良好的精密度，迷迭香酸RSD為0.67%。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按上述方法制備6份供試品溶液，分別測(cè)定，迷迭香酸RSD為0.81%。結(jié)果表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在放置0、1、2、4、6、8 h后精密吸取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積值，迷迭香酸RSD為0.89%，供試品溶液8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量 (迷迭香酸1.23 mg/mL)的同一批樣品適量，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液25 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為加樣供試液。精密吸取加樣供試液10 μL，按上述方法測(cè)定其峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果表明本方法回收率良好，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 迷迭香酸的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of rosmarinic acid

表3 迷迭香酸回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery test for rosmarinic acid

2.4 樣品測(cè)定 取3批樣品按“2.1”項(xiàng)下麝香草酚和香荊芥酚測(cè)定方法、“2.2”項(xiàng)下木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯測(cè)定方法和“2.3”項(xiàng)下迷迭香酸測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

麝香草酚和香荊芥酚測(cè)定時(shí)分別以甲醇-0.5磷酸溶液 (85∶15)、甲醇-2%冰醋酸溶液 (60∶40)和乙腈-2%冰醋酸溶液 (65∶35)為流動(dòng)相，結(jié)果甲醇－0.5磷酸溶液 (85∶15)分離效果不好，未達(dá)到基線分離;甲醇-2%冰醋酸溶液(60∶40)麝香草酚與其他色譜峰能達(dá)到基線分離但香荊芥酚與其他色譜峰不能達(dá)到基線分離。而乙腈-2%冰醋酸溶液 (65∶35)麝香草酚和香荊芥酚與其他色譜峰均能達(dá)到基線分離。故選用乙腈-2%冰醋酸溶液 (65∶35)為流動(dòng)相。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.4 Results of content determination

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