崔 玲，何云飛，徐燦輝

(1.益陽(yáng)市中醫(yī)院，湖南益陽(yáng) 413000;2.南華大學(xué)，湖南衡陽(yáng) 421001)

婦炎凈片是由苦玄參、地膽草、當(dāng)歸、兩面針、五指毛桃等九味中藥材組成的的復(fù)方制劑，具有清熱祛濕、行氣止痛的功效。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為“國(guó)家食品藥品管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ09362006-2009Z”，采用高效液相色譜法測(cè)定阿魏酸的量，未將君藥苦玄參的化學(xué)成分測(cè)定列入其中，為此，郭艷霞等［1］建立了高效液相色譜法測(cè)定苦玄參苷IA，婦炎凈其他劑型的苦玄參苷IA定量測(cè)定方法也有報(bào)道［2］。五指毛桃在處方中用量最大，具有健脾利濕、益肺止咳、舒筋通絡(luò)功效［3-4］，香豆素類(lèi)成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素是其主要功效性成分之一［5-6］，將其作為評(píng)價(jià)五指毛桃質(zhì)量的依據(jù)已被廣泛采用［7-8］，但是在婦炎凈片中的定量測(cè)定研究目前未見(jiàn)報(bào)道。為了全面控制產(chǎn)品質(zhì)量并簡(jiǎn)化定量測(cè)定方法，本實(shí)驗(yàn)以苦玄參苷IA、阿魏酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素作為指標(biāo)性成分，采用高效液相色譜梯度洗脫法對(duì)4種成分同時(shí)定量測(cè)定，以控制方中苦玄參、當(dāng)歸和五指毛桃的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀 (DAD檢測(cè)器)LC solution工作站，GB204電子分析天平 (梅特勒-托利多儀器有限公司)，CG-300超聲儀 (張家港市港威超聲電子有限公司)。苦玄參苷 IA對(duì)照品(111745-200501)，阿魏酸對(duì)照品 (110773-201313)，補(bǔ)骨脂素對(duì)照品 (110739-201115)，異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品 (110738-201012)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。婦炎凈片購(gòu)自海南葫蘆娃制藥有限公司 (批號(hào)130407，0.5 g/片)、江西藥都仁和制藥有限公司(批號(hào)130115，0.4 g/片)、秦皇島皇威制藥股份有限公司 (批號(hào)130605，0.4 g/片)。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm)(天津菲羅門(mén)科技有限公司生產(chǎn));1%冰乙酸為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫 (0～15 min，85%A;15～20 min，85%A→63%A;20 ～35 min，63%A;35 ～40 min，63%A→85%A;40～45 min，85%A);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量 10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別取苦玄參苷IA、阿魏酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，精密稱(chēng)定，用甲醇溶解并定量稀釋制成質(zhì)量濃度分別為750、125、50、60 μg/mL的溶液，作為對(duì)照品貯備溶液。各精密量取上述4種對(duì)照品的貯備溶液適量(0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL)，置同一25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品20片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約5片量，精密稱(chēng)定，置50 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中，蒸干，用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照樣品溶液 按處方量和制備工藝分別制備缺苦參的樣品、缺當(dāng)歸的樣品、缺五指毛桃的樣品和同時(shí)缺苦玄參、當(dāng)歸和五指毛桃的樣品，同供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照樣品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性 取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液分別注入色譜儀，記錄色譜圖。由圖1可見(jiàn)，陰性樣品溶液不干擾測(cè)定。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.4 線性 取“2.2.1”項(xiàng)配制的系列質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液，照上述色譜條件試驗(yàn)，記錄色譜圖，以峰面積 (Y)對(duì)質(zhì)量濃度 (X)進(jìn)行線性回歸，得到4種分析物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4種成分的線性范圍及回歸方程Tab.1 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients of four constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，苦玄參苷IA、阿魏酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素峰面積平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分 別 為 0.41%、0.63%、0.59%、0.44%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品 (批號(hào)130115)按“2.2.2”項(xiàng)制成供試品溶液，共6份，記錄色譜圖，將峰面積代入“2.4”項(xiàng)線性回歸方程計(jì)算各成分量。每片含苦玄參苷IA、阿魏酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的平均值分別為233、41、15、18 μg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)分別為 0.58%、0.68%、0.77%、0.85%，表明本法有較好的重復(fù)性。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品 (批號(hào)130115)按“2.2.2”項(xiàng)制成的供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣1次，共6次，記錄色譜圖，苦玄參苷IA、阿魏酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素峰面積平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)分別為 1.38%、1.05%、1.26%、0.88%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定樣品 (批號(hào)130115)約2.5片，精密稱(chēng)定，共9份，分別按樣品中所含各成分的80%、100%和120%計(jì)算，加入4種對(duì)照品的貯備溶液，按供試品溶液制備方法處理，按上述色譜條件測(cè)定，將峰面積代入“2.4”項(xiàng)線性回歸方程計(jì)算各成分量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests(n=9)

2.9 樣品測(cè)定 取3個(gè)不同生產(chǎn)廠家不同批號(hào)的樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)進(jìn)行處理，每批平行處理5份，按上述色譜條件測(cè)定，將峰面積代入“2.4”項(xiàng)下線性回歸方程計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 婦炎凈片中4種成分的測(cè)定結(jié)果 (n=5)Tab.3 Determination of four constituents in Fuyanjing Tablets(n=5)

3 討論

由于4種成分的極性差別較大，同時(shí)測(cè)定時(shí)采用梯度洗脫才能有效分離。根據(jù)各成分的理化性質(zhì)和色譜行為，分別采用了以甲醇與水、乙腈與純水、1%冰乙酸溶液與乙腈構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)。結(jié)果表明，以甲醇與水為系統(tǒng)基線的波動(dòng)較大，各成分的分離效果不理想，乙腈-純水系統(tǒng)色譜峰拖尾明顯，1%冰乙酸溶液與乙腈系統(tǒng)各成分的色譜峰峰型對(duì)稱(chēng)，理論塔板數(shù)高，分離度好。

通過(guò)調(diào)取DAD檢測(cè)的紫外光譜可知苦玄參苷IA、阿魏酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的最大吸收波長(zhǎng)分別為264、316、245、246 nm，與相關(guān)文獻(xiàn)一致［9-12］，由于苦玄參苷IA、阿魏酸在245 nm附近均有較強(qiáng)吸收，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的最大吸收波長(zhǎng)相近，補(bǔ)骨脂素在4種成分中含有量最低，因此，選擇補(bǔ)骨脂素的最大吸收波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，均能滿(mǎn)足定量測(cè)定的要求。

實(shí)驗(yàn)分別用乙醇、70%甲醇和甲醇作為溶劑對(duì)樣品分別進(jìn)行冷浸，回流和超聲提取，結(jié)果表明甲醇超聲提取完全且雜質(zhì)干擾峰較少。對(duì)超聲處理15、20、25、30、35 min進(jìn)行考察，結(jié)果表明超聲處理25 min后各成分量不再增加，考慮到樣品的差異性，選擇超聲處理30 min。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法梯度洗脫，能快速、準(zhǔn)確地同時(shí)測(cè)定婦炎凈片中苦玄參苷IA、阿魏酸、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的量，可作為婦炎凈片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)的參考。

［1］郭艷霞，劉 敬，陳道蓉，等.HPLC法測(cè)定婦炎凈片中苦玄參苷IA的含量［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31(3):54-56.

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