黃 莉，夏新華，譚喜平

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410208)

荊防小兒止咳口服液由荊芥、防風(fēng)、連翹、苦杏仁等12味中藥組方制備而成，具有清熱解表、止咳化痰的功效，臨床上主要用于治療小兒急性支氣管炎和小兒慢性支氣管炎的急性發(fā)作。防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng) Saposhnikovia divaricate(Turcz.)Schischk的干燥根［1］，色原酮類(lèi)化合物升麻素苷作為防風(fēng)中的主要化學(xué)成分，具有明顯的解熱鎮(zhèn)痛、抗炎免疫作用［2-3］，由于其水溶性低，在以水為主要溶劑而提取的口服液制劑制備過(guò)程中轉(zhuǎn)移率自然不高［4］，故選擇靈敏度好、穩(wěn)定性高的測(cè)定方法是十分必要的。連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實(shí)［1］，其特征性有效成分為木脂素類(lèi)物質(zhì)連翹苷，連翹苷具有抗炎解熱、解毒抗氧化等作用［5-6］，。鑒于連翹苷和升麻素苷均為荊防小兒止咳口服液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為控制該制劑的質(zhì)量，所建立的SPE-HPLC分析方法能夠明顯地減少雜質(zhì)干擾，具有快速、簡(jiǎn)便，良好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)荊防小兒止咳口服液的質(zhì)量控制有重要的指導(dǎo)意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 大連依利特液相色譜儀，配備P1201色譜泵、UV1201紫外檢測(cè)器、EC2006色譜工作站;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器有限公司);電子分析天平 (AY120 shimadzu 0.1 mg～120 mg);超聲清洗儀 (HS3120，3 L);電動(dòng)離心機(jī) (80-1型，4000 r/min，金壇市城西曉陽(yáng)電子儀器廠);玻璃層析柱 (長(zhǎng)40 cm，內(nèi)徑1 cm)。

1.2 試藥 升麻素苷 (批號(hào)111522-201209，中國(guó)食品藥品檢定研究院);連翹苷 (批號(hào)110821-200610，中國(guó)藥品生物制品檢定所);中性氧化鋁(100～200目、200～300目，F(xiàn)CP)、酸性氧化鋁(100～200目，F(xiàn)CP)、堿性氧化鋁 (100～200目，F(xiàn)CP)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);荊防小兒止咳口服液 (由本實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)20130815)，乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Kromasil ODS1色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫 (0～15 min，16%乙腈;15～50 min，22%乙腈)，體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品貯備液的制備 精密稱(chēng)取升麻素苷對(duì)照品 (于P2O5干燥器中干燥24 h)11.7 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得升麻素苷貯備液 (0.234 mg/mL)。精密稱(chēng)取連翹苷對(duì)照品 (于P2O5干燥器中干燥24 h)13.8 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得連翹苷貯備液 (0.276 mg/mL)。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密吸取升麻素苷、連翹苷對(duì)照品貯備液適量，同置于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋成升麻素苷0.0468 mg/mL、連翹苷0.0552 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

2.2.3.1 甲醇法 精密量取口服液4 mL，加一定量的甲醇超聲30 min，置于10 mL離心管中定容并離心10 min(4000 r/min)取上清液于0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得［7-8］。

2.2.3.2 正丁醇萃取法 精密量取口服液4 mL，用水飽和的正丁醇液萃取4次 (10 mL/次)，合并正丁醇液，于水浴蒸干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜?0 mL，超聲10 min，搖勻，于0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得［9］。

2.2.3.3 SPE萃取法 精密量取口服液4 mL，水浴蒸至近干，加中性氧化鋁2 g拌勻，加于中性氧化鋁柱 (100～200目，6 g，干法裝柱)的頂端，用50%乙醇40 mL洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至干，殘?jiān)眉状既芙?，超?0 min并定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得［10］。

2.2.4 陰性溶液的制備 按處方比例依據(jù)藥材提取工藝分別制備不含連翹和防風(fēng)及兩者均不含的陰性樣品藥液，按“2.2.3.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照和雙陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。在此條件下，升麻素苷和連翹苷的色譜峰型好，與其他組分基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按連翹苷計(jì)算大于3500，按升麻素苷計(jì)算在1000以上，且陰性樣品對(duì)升麻素苷、連翹苷的測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

2.4 供試品溶液制備中氧化鋁固相萃取條件的考察

圖1 專(zhuān)屬性的HPLC圖譜Fig.1 Specific chromatographs of HPLC

2.4.1 氧化鋁種類(lèi)的考察 分別稱(chēng)取中性、酸性和堿性氧化鋁4 g，各3份，干法裝柱 (玻璃層析柱長(zhǎng)40 cm，內(nèi)徑1 cm)，精密吸取樣品4 mL，蒸至近干，加入相應(yīng)種類(lèi)的氧化鋁2 g拌勻，加于氧化鋁柱頂端，用80 mL的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒊?0 min后定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定升麻素苷和連翹苷的量。結(jié)果表明，3種不同類(lèi)型的氧化鋁對(duì)樣品中升麻素苷和連翹苷的影響相近，考慮中性氧化鋁所處理的樣品分離效果和重復(fù)性好，而酸性和堿性氧化鋁處理的樣品測(cè)定結(jié)果誤差較大，故選擇中性氧化鋁作為固相萃取的固定相 (見(jiàn)表1)。

表1 不同性質(zhì)氧化鋁的影響 (n=3)Tab.1 Effect of Al2O3with different natures(n=3)

2.4.2 中性氧化鋁粒徑大小的考察 分別稱(chēng)取兩種不同粒徑的中性氧化鋁 6 g，各 3份，按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行。結(jié)果表明，樣品中升麻素苷和連翹苷的測(cè)得量受中性氧化鋁粒徑大小的影響較大，經(jīng)100～200目中性氧化鋁層析后所測(cè)得的升麻素苷和連翹苷的量較高，且重復(fù)性好。因此，中性氧化鋁的粒徑越小，對(duì)升麻素苷和連翹苷的吸附作用越強(qiáng)，能被洗脫劑洗脫出的量越低，故選用100～200目的中性氧化鋁作為固相萃取的固定相 (見(jiàn)表2)。

表2 不同粒徑中性氧化鋁的比較 (n=3)Tab.2 Comparison of neutral Al2O3with different particle sizes(n=3)

2.4.3 中性氧化鋁的活度考察 將部分層析用100～200目的中性氧化鋁于110℃真空干燥5 h提高活度，分別稱(chēng)取活化和未活化的100～200目的中性氧化鋁6 g，各3份，以下操作按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行。結(jié)果表明，中性氧化鋁活化與否對(duì)升麻素苷和連翹苷的測(cè)得量并沒(méi)有明顯的影響，但活化后的中性氧化鋁有明顯改善升麻素苷和連翹苷的基線分離效果，有利于提高樣品分析的重復(fù)性。

2.4.4 氧化鋁用量的考察

2.4.4.1 裝柱氧化鋁用量 分別稱(chēng)取100～200目的中性氧化鋁各2、4、6、8 g，填裝至玻璃層析柱(柱長(zhǎng)40 cm，內(nèi)徑 1 cm)中，精密吸取樣品4 mL，各4份，按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行。結(jié)果表明，裝柱氧化鋁用量不同，對(duì)被測(cè)物質(zhì)的吸附和保留效果存在不同影響，尤其是對(duì)連翹苷的測(cè)定有很大的影響。當(dāng)中性氧化鋁的裝柱用量為6 g時(shí)，升麻素苷和連翹苷的測(cè)得量均為最大值，故確定裝柱中性氧化鋁用量為6 g(見(jiàn)圖2)。

圖2 裝柱氧化鋁用量的影響Fig.2 Influence of dosage of Al2O3in the column

2.4.4.2 上樣氧化鋁用量 稱(chēng)取100～200目中性氧化鋁6 g，共4份，分別裝入4根玻璃柱 (柱長(zhǎng)40 cm，內(nèi)徑1 cm)中，精密吸取樣品4 mL，共4份，蒸至近干，分別加入1、2、3、4 g中性氧化鋁 (100～200目)拌勻，以下操作按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行。結(jié)果表明，不同用量的氧化鋁拌樣，測(cè)得的升麻素苷和連翹苷量存在一定的差異。當(dāng)采用2 g中性氧化鋁拌樣時(shí)，對(duì)兩者測(cè)得量的影響均最大，故確定上樣中性氧化鋁用量為2 g(見(jiàn)圖3)。

圖3 上樣氧化鋁用量對(duì)測(cè)得量的影響Fig.3 Effect of different loading dosages of Al2O3 to content

2.4.5 洗脫劑乙醇的考察 稱(chēng)取100～200目中性氧化鋁6 g，共4份，分別裝入4根玻璃柱 (柱長(zhǎng)40 cm，內(nèi)徑1 cm)中，精密吸取樣品4 mL，共4份，蒸至近干，加入相應(yīng)中性氧化鋁2 g拌勻，加于氧化鋁柱頂端進(jìn)行干法上樣，然后分別用30%、50%、70%和90%乙醇各80 mL洗脫氧化鋁柱，分別收集洗脫液，按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行。結(jié)果表明，50%乙醇和70%乙醇洗脫所得樣品中升麻素苷和連翹苷的量均高于90%乙醇洗脫所得樣品，而30%乙醇洗脫所得樣品的色譜圖中雜質(zhì)峰較多 (見(jiàn)圖4)。因此，從節(jié)約溶劑的角度，選擇50%乙醇作為洗脫劑為宜。

圖4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的影響Fig.4 Effect of different ethanol contents in the eluent

2.4.6 洗脫劑用量的考察 稱(chēng)取100～200目中性氧化鋁6 g，同上干法裝柱，精密吸取樣品4 mL，蒸至近干，同上進(jìn)行拌樣和上樣，用50%乙醇洗脫氧化鋁柱，以每份20 mL收集洗脫液，沖洗至洗脫液中無(wú)法檢測(cè)到升麻素苷和連翹苷為止，以下操作按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫液收集到第2份時(shí)，連翹苷已基本洗脫完全，故確定洗脫時(shí)50%乙醇的用量為40 mL(見(jiàn)圖5)。

圖5 洗脫劑用量的影響Fig.5 Effect of the eluent volume

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液2、5、8、10、12、15 μL，分別注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定升麻素苷和連翹苷的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。升麻素苷和連翹苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得回歸方程Y=46.823X－2.8277(r=0.9998)、Y=37.018X－14.574(r=0.9996)，結(jié)果表明升麻素苷和連翹苷分別在0.0936～0.7020 μg、0.1104～0.8280 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖峰面積，結(jié)果測(cè)得升麻素苷和連翹苷的RSD分別為1.02%和0.54%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液各10 μL，于0、2、4、8、12、24 h時(shí)注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的升麻素苷和連翹苷的RSD分別為1.50%和2.62%(n=6)，結(jié)果表明供試品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一批號(hào)的荊防小兒止咳口服液，按“2.2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果升麻素苷和連翹苷的RSD分別為2.38%和1.10%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取同一批號(hào)的荊防小兒止咳口服液，共6份，每份2 mL(升麻素苷和連翹苷分別為0.1047 mg/mL、0.2012 mg/mL)，分別加入升麻素苷對(duì)照品溶液 (0.234 mg/mL)0.9 mL、連翹苷對(duì)照品溶液 (0.276 mg/mL)1.45 mL，按“2.2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.3 Results of recovery tests(n=6)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 文獻(xiàn) ［11］表明，連翹苷在205 nm波長(zhǎng)處最為靈敏，但由于在低波長(zhǎng)處雜質(zhì)峰干擾較大，故參考《中國(guó)藥典》2010年版對(duì)升麻素苷和連翹苷進(jìn)行HPLC測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)，分別在254 nm和277 nm測(cè)定了混合對(duì)照品的HPLC色譜圖，以擴(kuò)大兩者的定量范圍。結(jié)果表明，當(dāng)波長(zhǎng)為277 nm時(shí)，升麻素苷和連翹苷的色譜峰響應(yīng)靈敏且峰型對(duì)稱(chēng)，其靈敏度明顯高于254 nm，故選擇277 nm作為同時(shí)定量分析兩種成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件的優(yōu)選 曾以不同比例的甲醇-水、甲醇-乙腈-水［12］、甲醇-0.05%磷酸水［13］、乙腈-水等作為流動(dòng)相，考察HPLC色譜峰的分離效果。結(jié)果表明，以甲醇-水組成流動(dòng)相系統(tǒng)，由于甲醇洗脫能力低于乙腈，會(huì)大大延長(zhǎng)樣品分析時(shí)間，且升麻素苷和連翹苷的峰型較差。而以乙腈-水組成流動(dòng)相系統(tǒng)，升麻素苷、連翹苷與其他雜質(zhì)峰分離良好，陰性無(wú)干擾，分析時(shí)間適宜。另外，連翹苷為木脂素類(lèi)成分，其極性較弱，故在分析連翹苷時(shí)，增大梯度洗脫系統(tǒng)中乙腈的比例，以縮短樣品的分析時(shí)間。

3.3 樣品處理方法的優(yōu)化 在供試品溶液制備方法考察中，曾采用甲醇法、正丁醇萃取法處理樣品，由于本口服液為中藥復(fù)方制劑，化學(xué)成分復(fù)雜，且含糖量大，導(dǎo)致兩個(gè)主要化學(xué)成分的液相色譜圖存在很多雜質(zhì)峰，文獻(xiàn) ［14-15］表明，氧化鋁固相萃取應(yīng)用于樣品的前處理時(shí)，有利于純化待測(cè)物質(zhì)和減少雜質(zhì)干擾，便于實(shí)現(xiàn)快速定量分析。升麻素苷和連翹苷的結(jié)構(gòu)不被Al3+所絡(luò)合，可洗脫，能去除糖、黃酮類(lèi)等成分的干擾。故在參照藥典條件的基礎(chǔ)上采用氧化鋁對(duì)口服液進(jìn)行固相萃取，并確保了升麻素苷和連翹苷色譜峰的良好分離效果。

3.4 氧化鋁柱層析條件分析 通過(guò)對(duì)氧化鋁柱層析條件的考察，確定了氧化鋁固相萃取的最佳條件:用中性氧化鋁6 g(100～200目)干法裝柱，并用中性氧化鋁2 g干法拌樣，洗脫劑為50%乙醇，洗脫體積為40 mL。采用中性氧化鋁固相萃取法處理樣品，能高度純化升麻素苷和連翹苷，避免其他雜質(zhì)的干擾，結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定兩者的含量，可以為該制劑建立簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確的定量分析方法。

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