杭州澳亞生物技術(shù)有限公司（310018）徐全華 陳青連 李紅菊

七葉皂苷鈉是從七葉樹(shù)科植物天師栗的干燥成熟種子中提取得到的皂苷鈉鹽，具有消腫、抗炎和改善血液循環(huán)的作用。用于腦水腫、創(chuàng)傷或手術(shù)后引起的腫脹，也用于靜脈回流障礙性疾病。

根據(jù)中國(guó)藥典2010年版二部無(wú)菌檢查法的規(guī)定[1]，建立藥品無(wú)菌檢查方法時(shí)，應(yīng)該進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以證明方法的適用性。為確保該產(chǎn)品檢查方法科學(xué)、結(jié)果準(zhǔn)確，本文建立了注射用七葉皂苷鈉無(wú)菌檢查方法，并對(duì)檢查方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 儀器與材料

XG1.DWXD-0.36型脈動(dòng)真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械廠）；HTY-Ⅲ型智能集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）；KDGB220、KDGB330型一次性全封閉集菌培養(yǎng)器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）；LRH-250-Ⅱ型、LRH-250型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）。

注射用七葉皂苷鈉（規(guī)格：5mg，杭州澳亞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1106145、1106184、1106185）。

試驗(yàn)用菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC(B)26003]；銅綠假單孢菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]；生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B)64 941]；大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102]；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)980 01]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]。上述菌種由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

驗(yàn)證用培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基；改良馬丁培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基由杭州微生物試劑有限公司提供。

稀釋液和沖洗液：0.1%蛋白胨水溶液（杭州澳亞生物技術(shù)有限公司質(zhì)檢部配制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 取金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物，用白金耳接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，取生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物，用白金耳接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，32.5℃培養(yǎng)24h。取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，25.5℃培養(yǎng)24h。上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。

取黑曲霉斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25.5℃培養(yǎng)5d使大量孢子成熟，加5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，用白金耳輕輕將孢子洗脫，用管口帶紗布的無(wú)菌毛細(xì)吸管吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉注射液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。

2.2 菌液計(jì)數(shù) 分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各1ml于培養(yǎng)皿中，每種菌做兩個(gè)平皿，加營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；取白色念珠菌、黑曲霉菌各1ml于培養(yǎng)皿中，每種菌做兩個(gè)平皿，加玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，按規(guī)定條件培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)附表1。由附表1可知，各菌種在相應(yīng)的稀釋度下，每毫升菌落計(jì)數(shù)結(jié)果符合規(guī)定。

附表1 微生物計(jì)數(shù)結(jié)果

2.3 培養(yǎng)基的無(wú)菌性試驗(yàn) 取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基各8支，在相應(yīng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)14d，結(jié)果顯示兩種培養(yǎng)基的無(wú)菌性符合規(guī)定，見(jiàn)附表2。（注：“+”代表有菌生長(zhǎng)，“-”代表無(wú)菌生長(zhǎng)，以下表格符號(hào)意義相同）

附表2 培養(yǎng)基的無(wú)菌性檢查結(jié)果

2.4 培養(yǎng)基的靈敏度試驗(yàn) 取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，按相應(yīng)條件培養(yǎng)3d。取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，按相應(yīng)的條件培養(yǎng)5d。每天觀察記錄，結(jié)果見(jiàn)附表3。由附表3可知，培養(yǎng)基的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定。

附表3 培養(yǎng)基的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 薄膜過(guò)濾法方法學(xué)驗(yàn)證 每批取供試品180支，用0.1%蛋白胨緩沖液溶解供試品，每10支為一組，分成18組，每組使用一個(gè)過(guò)濾器，其中6組未用沖洗液沖洗，另6組沖洗量為100ml，再6組沖洗量為200ml，在最后一次沖洗液中加入每1ml小于100cfu的試驗(yàn)菌1ml，過(guò)濾后，將相應(yīng)的培養(yǎng)基100ml加至各濾筒內(nèi)作為供試品陽(yáng)性對(duì)照（PPC）。另取集菌培養(yǎng)器，不過(guò)濾供試品，其他操作同上，作為陽(yáng)性對(duì)照（PC）。按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d，各試驗(yàn)菌同法操作，結(jié)果見(jiàn)附表4、附表5、附表6。由附表4～6可知，三批產(chǎn)品在設(shè)定沖洗量為未沖洗、100ml和200ml條件下，對(duì)6種菌株而言供試品陽(yáng)性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均生長(zhǎng)良好，且無(wú)明顯差異，均無(wú)抑菌作用，因此確定該產(chǎn)品無(wú)菌檢查方法為：取本品，用0.1%蛋白胨水溶液溶解，采用薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，無(wú)需經(jīng)沖洗液沖洗，直接加相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

附表4 注射用七葉皂苷鈉方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果（批號(hào)：1106145）

2.6 樣品的無(wú)菌檢查 每批取供試品30支，用0.1%蛋白胨水溶液溶解供試品，取三聯(lián)管全封閉集菌培養(yǎng)器直接過(guò)濾，其中一管加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，另一管加入100ml改良馬丁培養(yǎng)基，第三管加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基并接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌菌液作供試品陽(yáng)性對(duì)照，另取稀釋液，同法操作，作為陰性對(duì)照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)14d，結(jié)果見(jiàn)附表7。由附表7可知，三批產(chǎn)品按驗(yàn)證確定的方法進(jìn)行檢查，供試品陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立，產(chǎn)品符合無(wú)菌要求。

附表5 注射用七葉皂苷鈉方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果（批號(hào)：1106184）

附表6 注射用七葉皂苷鈉方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果（批號(hào)：1106185）

附表7 樣品無(wú)菌檢查試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

根據(jù)《中國(guó)藥典》二部附錄Ⅺ無(wú)菌檢查法的要求，無(wú)菌檢查法包括薄膜過(guò)濾法和直接接種法，只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法，因此本品采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行了相應(yīng)的研究。此外，由于注射用七葉皂苷鈉為非抗菌藥物，因此，選擇金黃色葡萄球菌作陽(yáng)性對(duì)照菌。研究結(jié)果表明：注射用七葉皂苷鈉在試驗(yàn)菌液計(jì)數(shù)及所用培養(yǎng)基無(wú)菌性、靈敏度符合規(guī)定條件下，三批產(chǎn)品經(jīng)驗(yàn)證各陽(yáng)性對(duì)照組生長(zhǎng)情況均成立，未經(jīng)沖洗和沖洗量為100ml和200ml的供試品陽(yáng)性對(duì)照組生長(zhǎng)情況與陽(yáng)性對(duì)照組均生長(zhǎng)良好，并且無(wú)明顯差異，無(wú)抑菌作用。三批樣品經(jīng)檢查，符合無(wú)菌要求。因此，確定該產(chǎn)品無(wú)菌檢查方法為：取本品，用0.1%蛋白胨水溶液適量使溶解，用薄膜過(guò)濾法處理后，無(wú)需沖洗液進(jìn)行沖洗，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。通過(guò)上述驗(yàn)證所建立的方法可用于注射用七葉皂苷鈉的無(wú)菌檢查，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。