萬世明 易少奎 仲 嘉 王衛(wèi)民 蔣恩明 陳柏湘 高澤霞

(1. 華中農業(yè)大學水產學院, 農業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室, 農業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430070;2. 淡水水產健康養(yǎng)殖湖北省協同創(chuàng)新中心, 武漢 430070; 3. 湖北百容水產良種有限公司, 黃岡 438800)

魚類的肌間骨(Intermuscular bone)是由肌膈結締組織連續(xù)同源骨化而來的膜骨, 通過結締組織連在其他骨骼上, 起著加強肌節(jié)間聯系的作用[1]。我國淡水主要養(yǎng)殖魚類, 如鯽魚(Carassius carassius)、草魚(Ctenopharyngodon idella)、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)等鯉科魚類普遍存在復雜的肌間骨, 對魚肉的食用帶來極大不便[2]。魚類的肌間骨根據附著的部位可以分為三類, 包括髓弓小骨、椎體小骨和脈弓小骨[3,4]。低等真骨魚類普遍存在肌間骨, 且髓弓小骨形態(tài)的演化與低等真骨魚類的系統演化進程有著一致性[5]。國內外對魚類肌間骨的研究多處于形態(tài)方面[4—7], 且主要集中在對不同魚類成體的肌間骨研究, 缺乏對其發(fā)生發(fā)育的觀察, 僅秉志[8]、Bird 和Mabee[9]、柯中和等[10]和呂耀平等[11]分別對鯉科魚類的鯉(Cyprinus carpio)、斑馬魚(Danio rerio)、鰱、唇魚骨(Hemibarbus labeo)肌間骨的骨化時間及發(fā)育進行了描述。

團頭魴隸屬于鯉形目(Cypriniformes), 鯉科(Cyprinidae), 鲌亞科(Culterinae), 魴屬(Megalobrama), 是我國特有的重要草食性經濟魚類之一[12],近幾年對其基因與分子標記資源的開發(fā)有了較多研究[13,14]。在骨骼研究方面, 蘇錦祥等[15]對團頭魴骨骼系統的發(fā)育進行了報道, 董在杰等[6]在對幾種常見鯉科魚類肌間骨進行分析比較的時候, 已簡要概括了團頭魴成魚肌間骨的分布和形態(tài)特征。本研究在其基礎上, 通過對團頭魴仔稚魚肌間骨骨化發(fā)育的觀察, 以及對不同大小個體團頭魴肌間骨數量與形態(tài)的分析, 初步闡明了團頭魴肌間骨發(fā)育的基本規(guī)律; 同時探討了肌間骨骨化、發(fā)育、長度與個體年齡和生長的關系。本研究結果為今后揭示團頭魴肌間骨發(fā)生與發(fā)育的分子機制提供了必要的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

用于肌間骨染色的團頭魴仔、稚魚樣本從孵出后開始采集, 每隔5天取一次樣本, 每次10尾。用95%酒精固定, 一直取到孵出后50d, 即肌間小骨全部出現為止。形態(tài)解剖中不同大小個體的團頭魴共29尾, 體重為(4.0—600.2) g, 體長為(5.5—35.5) cm。按照月齡與大小將29尾團頭魴分為4組(表1)。用于 X光透射的成體團頭魴兩尾, 體重(400—450) g,體長為(25.5—26.3) cm。以上實驗魚均取自華中農業(yè)大學水產學院團鳳百容養(yǎng)殖基地。

表1 實驗中不同大小規(guī)格團頭魴的體重與體長Tab. 1 The weight and length of M. amblycephala with different sizes

1.2 仔、稚魚骨骼染色方法

按照柯中和等的研究方法[10], 其中步驟(3)、(4)做以下調整: (3) 轉移標本至1% KOH溶液中浸泡30min, 使組織透明, 體長大于20 mm的稚魚則適當延長浸泡時間直至組織透明; (4) 經透明的標本轉移至新的1% KOH 溶液中, 滴加茜素紅染色液(1 g茜素紅溶于100 mL 1% KOH 溶液中配制成染色液),直至溶液顏色變?yōu)樯钭仙? 染色(2—6)h (具體時間根據魚體大小和季節(jié)溫度調整), 倒掉染色液, 用1% KOH 溶液洗去組織中殘余的染色液。其他步驟不變。骨骼染色的標本經體視解剖鏡和高倍顯微鏡觀察和拍照, 記錄肌間骨數目、位置及形態(tài)。

1.3 肌間骨數目、形態(tài)的觀察與測定

在活魚麻醉后, 經紗布擦干魚體后進行體重與體長的測量。測量完后用紗布將整個魚體包好, 并用細線扎緊, 置沸水鍋中煮(5—10)min。取出, 冷卻后去除紗布, 剝去皮膚后, 用鑷子小心剔除肌肉,依次從前往后取出肌間骨, 然后用數碼相機拍照。參考董在杰等[6]的方法將魚體劃分為軀干部軸上肌、軀干部軸下肌、尾部軸上肌和尾部軸下肌4個部位, 記錄不同部位肌間骨數目及形態(tài)(圖1)。用游標卡尺測定各肌間骨的長度。

1.4 X光透射法

將研究的團頭魴送至華中農業(yè)大學校醫(yī)院放射科, 進行X光透射拍照。觀察并記錄肌間骨的數量、形態(tài)與分布。

圖1 團頭魴肌間骨取樣區(qū)域Fig. 1 The sampling zone of intermuscular bones for M. amblycephala

2 結果

2.1 團頭魴肌間骨的發(fā)育和骨化

在對所采樣本進行肌間骨染色觀察后發(fā)現: 孵出后20天之前的團頭魴仔稚魚沒有肌間骨存在; 第20天的樣本中, 仔稚魚其他骨骼包括主軸骨骼及附肢骨骼已骨化完全, 游泳攝食能力完善(圖版Ⅰ-A),且生長發(fā)育快的、體長為1.33 cm的團頭魴已出現肌間骨, 包括兩根“1”形髓弓小骨與一根“1”形脈弓小骨(圖版Ⅰ-B)。之后, 肌間骨不斷向頭部方向分化出現; 第25天, 體長為1.63 cm時, 髓弓小骨在背鰭下方出現, 形態(tài)都為“1”形(圖版Ⅰ-C); 第 27 天, 髓弓小骨在背鰭前方開始出現, 而生長發(fā)育快的大個體(體長為2.05 cm)已出現至頭后方, 并在軀干軸上部分出現了少量“卜”形與“y”形肌間骨(圖版Ⅰ-D、圖版Ⅰ-E); 第30天, 體長為1.80 cm時, 團頭魴的肌間骨已明顯骨化, 形態(tài)清晰, 軀干軸上部分出現大量“y”形肌間骨(圖版Ⅰ-F), 尾部出現完整明顯的“1”形肌間骨(圖版Ⅰ-G); 在第 40天, 體長為 2.36 cm 時,肌間骨基本全部出現。團頭魴的髓弓小骨與脈弓小骨都是從尾部向前端依次出現, 其形態(tài)隨其生長發(fā)育由尾部向頭部方向逐漸復雜化。

2.2 不同大小團頭魴的肌間骨數目與長度

通過比較了 29尾不同大小個體團頭魴肌間骨數目發(fā)現: 不同大小規(guī)格的 4個組合團頭魴肌間骨數目并無顯著差異(P>0.05), 團頭魴肌間骨數目在108—129, 左右兩側肌間骨數目在 53—67。實驗中發(fā)現每尾魚左右兩側的肌間骨數目不完全相等, 但總體上左右兩側肌間骨的數目接近(表2)。

團頭魴仔稚魚階段其肌間骨長度是隨其生長明顯增加的, 本研究對不同月齡團頭魴肌間骨長度進行了解剖測量, 結果顯示肌間骨長度仍然隨其生長顯著增加(P<0.05)(圖2)。團頭魴軀干軸上肌中的肌間骨顯著長于尾部肌肉中的肌間骨(P<0.05), 軀干軸下肌中的肌間骨最短, 尾部軸上肌與尾部軸下肌中的肌間骨長度無明顯差異。12月齡小個體團頭魴中軀干上肌間骨平均長度為(7.83±1.16) cm, 尾部上肌間骨長度為(7.14±1.09) cm, 尾部下肌間骨長度為(7.02±0.77) cm, 軀干下肌間骨長度為(5.96±0.23) cm。而 12月齡的大個體團頭魴肌間骨要顯著長于小個體團頭魴(P<0.05), 其中軀干上肌間骨平均長度為(11.70±2.36) cm, 尾部上為(10.92±1.47) cm, 尾部下為(10.61±1.81) cm, 軀干下為(9.65±0.12) cm。

表2 不同大小個體團頭魴肌間骨數目Tab. 2 The number of intermuscular bones (IB) of M. amblycephala with different sizes

圖2 不同大小團頭魴肌間骨長度Fig. 2 The length of intermuscular bones of M. amblycephala with different sizes (Unit: mm)

2.3 團頭魴肌間骨形態(tài)與分布

本研究結果將團頭魴肌間骨形態(tài)分為“1”形、“卜”形、“y”形、一端多叉形、兩端多叉形和“(”形6種類型。在團頭魴仔稚魚的連續(xù)染色觀察中發(fā)現:“卜”形表現為“y”形、一端多叉形和兩端多叉形發(fā)育過程中的過渡形態(tài)。團頭魴左右兩側不同部位的肌間骨數目有差異, 軀干部軸上肌中的肌間骨數目最多, 平均為 22根, 且隨著團頭魴個體的變大, 在軀干部軸上肌的分叉肌間骨中發(fā)現了兩端分叉與一端分為3—4枝的情況, 肌間骨形態(tài)多樣性增加(表3)。尾部軸上肌與軸下肌中的肌間骨數目非常相近, 且多為“1”形。軀干部軸下肌中的肌間骨最少, 且均分布在腹腔與尾部的過渡區(qū)域。肌間骨整體形態(tài)以“1”形和“y”形為主(表 3); 在此基礎上, 出現 1—4個分支, 其中一端多叉形、兩端多叉形的肌間骨多存在于12月齡大個體與24齡成魚, 且形態(tài)最多樣(圖3)。X光透射圖像清晰地展現了團頭魴肌間骨在魚體中的發(fā)生區(qū)域、與主軸骨骼及附肢骨骼的相對分布位置、數量及形態(tài)(圖版Ⅱ)。

3 討論

3.1 團頭魴肌間骨的骨化與發(fā)育

魚類骨骼的骨化是一個非常復雜的過程。在對魚類骨骼系統的研究中, 多為椎骨的研究, Mabee等[16]對魚類椎骨發(fā)生及椎骨與魚類進化之間的關系進行了研究, Bird和Mabee[9]對斑馬魚的椎骨的發(fā)育演化進行了研究。國內對魚類肌間骨的研究多處于形態(tài)方面的研究, 且處于初步研究階段, 對于肌間骨的形成原因、演化規(guī)律、發(fā)育的分子機制等方面的

研究尚未開展。肌間骨形態(tài)發(fā)生規(guī)律的研究, 是研究其發(fā)育分子機制的基礎?？轮泻偷萚10]研究發(fā)現鰱的肌間骨骨化的時間較晚, 在主軸骨骼及附肢骨骼出現之后才開始骨化, 其第一枚肌間骨在43dpf (體長為 10.50 mm)時出現。呂耀平等[11]研究發(fā)現唇魚骨的肌間骨在35dpf (體長為23.67 mm)開始在尾部區(qū)域骨化。本研究發(fā)現團頭魴在孵出后20d肌間骨骨化出現時, 其主軸骨骼及附肢骨骼已骨化完全,魚體運動覓食能力已基本完善, 與前者研究相一致,且同一時期肌間骨出現與尚未出現的魚運動攝食能力并無顯著差異。因此, 在肌間骨形成之前抑制其骨化出現, 理論上不會對魚體主要骨骼的分化發(fā)育與生長產生影響; 抑制團頭魴肌間骨骨化, 培育無肌間骨的團頭魴, 在理論上應該是可行的。

表3 團頭魴肌間骨形態(tài)與分布統計Tab. 3 The distributions of intermuscular bones of M. amblycephala

圖3 不同大小團頭魴肌間骨形態(tài)分布Fig. 3 The morphologic patterns of intermuscular bones of M. amblycephala with different sizes

從團頭魴仔稚魚肌間骨染色觀察實驗中發(fā)現團頭魴的脈弓小骨與髓弓小骨都是從“1”形肌間骨逐步分化發(fā)育而來的, 形態(tài)復雜的髓弓小骨按照“1”形→“y”形→多叉形的方向分化發(fā)育。幼魚在孵出后20d左右(體長約1.33 cm)出現第一根肌間骨; 40d左右(體長約2.1 cm), 肌間骨基本完全出現; 之后隨著魚體的生長, 軀干軸上肌的髓弓小骨形態(tài)不斷分化復雜, 直到成體團頭魴的生長過程中, 肌間骨形態(tài)依然在分化。這說明肌間骨的分化是伴隨魚體生長不斷進行的, 形態(tài)越復雜的肌間骨形成越晚。此外,同一時期樣本仔稚魚所含的肌間骨數量與分化程度不完全相同, 第25天、體長1.45 cm的仔稚魚已經有超過15根的肌間骨, 而1.36 cm的仔稚魚尚未出現肌間骨; 第27天、體長2.05 cm的仔稚魚軀干軸上肌已經分化出“y”形肌間骨, 而第30天、體長1.33 cm的仔稚魚僅存在尾部“1”形肌間骨。這些結果表明團頭魴肌間骨出現與分化的時間受生長發(fā)育的影響大于日齡的影響。

3.2 團頭魴肌間骨的數目與長度

本研究發(fā)現不同大小規(guī)格的團頭魴(5.5—35.5 cm)肌間骨數目無顯著差異(P>0.05), 在 108—129, 平均為 119根, 與董在杰等[6]對團頭魴等鯉科魚類肌間骨數目的研究結果相近。同時, 團頭魴的肌間骨數目并不是呈兩側對稱分布的, 但十分接近。這與目前國內學者孟慶聞等[3]的研究是不一致的, 其在對鰱的肌間骨研究中發(fā)現肌間骨是兩側成對分布的。但后來國內學者的研究中發(fā)現魚類的肌間骨并不呈兩側對稱分布[5,6], 與本研究得到的結論是相同的。

團頭魴的肌間骨是由肌膈結締組織連續(xù)同源骨化而來的膜骨, 肌間骨的長度與團頭魴的體重和體長呈正相關。本研究發(fā)現團頭魴軀干軸上肌肌肉最多, 肌間骨的長度也最長; 相反, 軀干軸下肌由于腹腔的存在其肌肉最少, 肌間骨的長度最短。這間接說明了團頭魴肌間骨的長度與肌肉的分布存在密切的聯系, 肌肉多的軀干軸上肌間骨長度要大于肌肉少的軀干軸下肌間骨。Johnson和 Patterson[17]對魚類肌間骨的研究認為: 魚類肌間骨可能起著傳導肌肉力量與支撐肌肉的作用。因此, 可以推斷團頭魴軀干軸上與軸下肌中的肌間骨長度差異可能是因肌肉的分布差異造成的, 肌間骨的生長與肌肉的生長是同步的, 這與本研究中肌間骨發(fā)育與魚體生長發(fā)育相關聯的結果是互相印證的。

3.3 團頭魴肌間骨的形態(tài)與分布

魚類肌間骨的形態(tài)表現出多樣性[18], 且與存在部位有一定關系。本研究發(fā)現團頭魴軀干上肌中的肌間骨形態(tài)最為復雜, 而尾部肌肉中的肌間骨要相對簡單, 這與董在杰等[6]對團頭魴肌間骨的研究結果是一致的。關于肌間骨的形態(tài)類型, Patterson和Johnson[4]從系統進化的角度分析認為骨舌魚總目最原始的肌間小骨形態(tài)是沒有分叉的, 在此之后的骨鰾總目, 包括鯉形目的鯉科、胭脂魚科、鰍科魚類,脂鯉目魚類, 鲇形目魚類等的肌間骨都是從“1”形肌間骨演化而來的[4,5]。呂耀平等[5]通過觀察各種低等真骨魚類肌間小骨的形態(tài), 認為肌間骨的演化是從簡單的“1”形逐步演化為復雜的“卜”形、“y”形、兩端多叉形和樹枝形。本研究根據對不同個體大小團頭魴肌間骨形態(tài)的觀察, 認為團頭魴肌間骨的演化過程與呂耀平等[11]報道的研究結果是一致的。在本研究中還發(fā)現團頭魴肌間骨形態(tài)存在“(”形, 根據其所處位置及形態(tài)特征, 推測其為受到肌肉張力及發(fā)育限制后的“卜”形的未發(fā)生體或者“1”形的變形體。