張馨月 劉 巖 張秀梅 高天翔

(1. 中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 青島 266003; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所, 廣州 510300)

目前, 國際上廣泛使用 FishBase (http://fishbase.org)等魚類分類檢索系統(tǒng)進(jìn)行魚類形態(tài)學(xué)鑒定, 但由于部分地區(qū)魚類開發(fā)和研究水平不一, 因此單一的形態(tài)學(xué)鑒定無法完全滿足物種鑒定的需求。DNA序列輔助分類作為一個(gè)理想的輔助形態(tài)學(xué)分類手段應(yīng)運(yùn)而生, 迄今已有 30多年歷史。2003年, Hebert等[1,2]明確提出了DNA條形碼(DNA barcoding)的概念, 即通過使用短的、標(biāo)準(zhǔn)化的基因片段來進(jìn)行物種鑒定, 以提高真核生物識別的效率, 同時(shí)使得DNA序列輔助分類方法得到一定程度的統(tǒng)一, 加快進(jìn)程發(fā)展。目前, DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)成為一個(gè)被廣泛接受的物種鑒定工具, 它重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)驗(yàn)證[3], 亦被稱為 DNA分類學(xué)[4]。目前, 線粒體細(xì)胞色素 C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因是動(dòng)物 DNA條形碼研究中使用最為廣泛的標(biāo)準(zhǔn)基因[5], 因?yàn)樗緷M足DNA條形碼理想序列的3個(gè)基本判斷標(biāo)準(zhǔn): (1)序列變異水平適宜; (2)變異區(qū)域兩端的序列高度保守; (3)序列長度適宜[6]。這一結(jié)論在許多魚類[6,7]、昆蟲[8,9]和鳥類[10]等動(dòng)物中均得到很好驗(yàn)證。

西南大西洋公海漁場涵蓋巴西北部至阿根廷南部的南美洲東部沿海, 巴西暖流和?？颂m寒流在此交匯產(chǎn)生渦流,為多種海洋漁業(yè)資源生物提供產(chǎn)卵場和索餌場。因此, 西南大西洋公海漁場漁業(yè)資源豐富, 許多國家、地區(qū)的拖網(wǎng)及魷釣船只在此作業(yè)。我國在西南大西洋公海漁場拖網(wǎng)作業(yè)始于 2008年, 起步較晚, 因此我國對于該海域的相關(guān)研究相對較少, 尤其關(guān)于該海域常見漁獲種類的研究報(bào)道在國內(nèi)仍屬空白。同時(shí), 拖網(wǎng)作業(yè)對于物種的選擇度不高, 所得漁獲物種類十分豐富, 為了更好地認(rèn)識漁獲物的生態(tài)習(xí)性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 正確鑒定所得漁獲的種類顯得尤為重要。本文旨在針對西南大西洋公海部分拖網(wǎng)漁獲物進(jìn)行DNA條形碼研究, 探索其在魚類輔助物種鑒定中的適用性, 以期填補(bǔ)我國對該海域魚類DNA條形碼相關(guān)研究的空白, 為我國遠(yuǎn)洋拖網(wǎng)漁業(yè)發(fā)展提供更多的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與形態(tài)學(xué)鑒定

本研究樣本來自于山東榮成某漁業(yè)集團(tuán)有限公司的雙拖網(wǎng)生產(chǎn)船在西南大西洋(44.8°—47.0°S, 59.5°—61.0°W)巴塔哥尼亞海域探捕作業(yè)生產(chǎn)時(shí)隨機(jī)采集的漁獲物, 采集時(shí)間為2011年1—4月。

參照文獻(xiàn)[11—14]、FishBase(http://fishbase. org/)等進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定, 樣品初步判定為 14個(gè)物種, 參考綜合分類學(xué)信息系統(tǒng)(Integrated Taxonomic Information System,ITIS) 和《拉漢世界魚類名典》[15]對物種的有效名以及分類地位進(jìn)行確定(表 1)。對每個(gè)樣品拍照記錄, 取背部肌肉組織, 用95%乙醇固定, –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

取約 100 mg的肌肉組織經(jīng)蛋白酶 K消化后, 參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的酚/氯仿抽提法[16], 提取基因組DNA, 于–20℃存放。COⅠ基因序列擴(kuò)增引物為[6]: F1:5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′ F2: 5′-TC GACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3′; R1: 5′-TAGAC TTCTGGGTGGCCA AAGAATCA-3′; R2: 5′-ACTTCAGG GTGACCGAAGAATCAGAA-3′。

將F1與F2等體積混勻標(biāo)記為引物F, R1與R2等體積混勻標(biāo)記為引物 R, –20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)總體積為 25 μL, 其中包含: 超純水 17.25 μL, 10×Buffer 2.5 μL,dNTPs 2 μL, 5 μmol/ L 濃度的引物各 1 μL, Taq聚合酶0.25 μL和DNA模板 1 μL。PCR反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性2min; 94℃變性0.5min, 52℃退火0.5min和72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán); 72℃延伸 10min; 最后保持在 4℃[6]。所有的PCR反應(yīng)均在Biometra熱循環(huán)儀上完成。每組PCR反應(yīng)均設(shè)置陰性對照用來檢測是否存在污染。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 目的產(chǎn)物經(jīng)小量膠回收試劑盒(上海華舜)純化后, 送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序, 以確保序列的可靠性。

1.3 物種核對與序列分析

利用Dnastar軟件包(DNASTAR.Inc., Madison.USA)進(jìn)行序列比對、拼接, 并輔以手工調(diào)整。利用DNASP[17]軟件計(jì)算序列的變異位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)和單倍型多樣性等。用MEGA4.0軟件[18]分析核苷酸組成, 基于Kimura-2-parameter雙參數(shù)模型(K2P)計(jì)算遺傳距離, 利用鄰接法(Neighbor joining)構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹, 經(jīng)1000次重復(fù)抽樣(Bootstraps)檢測其置信度。

同時(shí)將所測得序列與NCBI (National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站以及BOLD參考條碼庫(Reference Barcode Database)中的同源片段序列進(jìn)行比對,輔助評估形態(tài)學(xué)分類的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定及有效種名的確定

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定, 最終確認(rèn)的魚類有效種名及其分類地位如表1 所示。71個(gè)樣本分屬于2綱6目10科14種。通過綜合比較, 發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)[11—14]中相關(guān)魚類的物種信息存在一定差異。因此, 樣本的物種鑒定又輔以 FishBase網(wǎng)站, 采用三種資料中一致性良好的物種描述信息進(jìn)行種類鑒定。并最終參考分類學(xué)信息系統(tǒng)(Integrated Taxonomic Information System, ITIS)和《拉漢世界魚類名典》[15]確定所研究樣本的有效種名(圖1)。

2.2 COⅠ基因片段序列分析

所測定的71條序列長度均約為652 bp, 沒有插入和缺失。輻鰭魚綱的58條COⅠ序列的平均堿基組成為T:29.7%、C: 28.1%、A: 23.5%、G: 18.8%, 其中, A+T含量(53.2%)高于G+C含量(46.9%); 軟骨魚綱的13條COI序列的平均堿基組成為T: 31.8%、C: 26.2%、A: 25.2%、G:16.9%, 其中A+T含量(57%)明顯高于G+C含量(43.1%)。同時(shí), 硬骨魚綱的GC含量高于軟骨魚綱鰩類的GC含量,這與Ward等[6]的研究結(jié)果相一致。各密碼子的堿基含量結(jié)果顯示, 第1密碼子位點(diǎn)GC含量(54.3%)顯著高于第2和第3密碼子位點(diǎn)(44.5%和38.6%), 堿基組成表現(xiàn)出明顯偏倚性。

各分類階元遺傳距離(K2P)如表 2所示, 種內(nèi)遺傳距離平均為0.0028, 而同屬物種間的遺傳距離為0.0335, 約為種內(nèi)遺傳距離的12倍, 這與Hebert等[8]提出的“10×規(guī)則”相一致。同樣, 科內(nèi)屬間遺傳距離平均為 0.1866, 同目的科間平均為 0.2361, 同綱內(nèi)平均為 0.2369以及不同綱間平均值為 0.3184。由此可見, 遺傳距離(K2P)隨著分類階元的提高而增大, 且種以上分類階元隨著其等級的升高, 其遺傳距離(K2P)的增長明顯減緩。

2.3 DNA條形碼序列比對

將本研究獲得的COⅠ基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對分析, 結(jié)果顯示, 除眼點(diǎn)平 鲉(Sebastes oculatus)外, 所有物種均具有一致性大于98%的同源DNA條形碼序列, 其中 13個(gè)魚種形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與一致性最高的比對結(jié)果相對應(yīng)。數(shù)據(jù)庫中與形態(tài)鑒定為眼點(diǎn)平鲉(Sebastes oculatus)一致性最高的序列為南太平洋密星平鲉(Sebastes constellatus)(100%), 但后者形態(tài)特征與分布情況同該魚種差距甚大, 因此將該樣本確定為比對結(jié)果中一致性為99% 的眼點(diǎn)平 鲉。

將所有序列再導(dǎo)入BOLD系統(tǒng)v3中進(jìn)行檢索, 以進(jìn)一步核實(shí)物種的分類地位以及有效的物種名。BOLD中檢索結(jié)果與 NCBI網(wǎng)站比對結(jié)果基本一致。但鞍斑杜父鱸?(Cottoperca gobio)在 BOLD系統(tǒng)中比對結(jié)果為似杜父鱸?(Cottoperca trigloides)(99%), 二者均為牛魚科杜父鱸 ?屬(Cottoperca), 似杜父鱸 ?(Cottoperca trigloides)在綜合分類學(xué)信息系統(tǒng)(Integrated Taxonomic Information System, ITIS)和《拉漢世界魚類名典》中均無記錄, 且FishBase等數(shù)據(jù)庫中也僅對其分布區(qū)域有所描述, 為南極洲海域底棲性魚類, 其形態(tài)學(xué)描述和圖片處于缺少狀態(tài)。由于 FishBase 所描述的物種似杜父鱸 ?(Cottoperca trigloides)分布區(qū)域與本實(shí)驗(yàn)樣品采集地點(diǎn)不一致, 故此魚種種名最終根據(jù)形態(tài)鑒定和 GenBank比對的結(jié)果確定為鞍斑杜父鱸(Cottoperca gobio)。

2.4 分子系統(tǒng)學(xué)分析

表2 各分類階元遺傳距離(K2P)統(tǒng)計(jì)表Tab. 2 Summary of genetic divergences (K2P) within various taxonomic levels

本文涉及14個(gè)物種的71條COⅠ序列共有28個(gè)單倍型, 基于28個(gè)單倍型構(gòu)建系統(tǒng)樹(圖2)。由圖可以看出,各物種的個(gè)體均各自聚為獨(dú)立的一支, 且不同物種界限清晰。各分類階元內(nèi)的聚類結(jié)果基本與形態(tài)學(xué)分類相一致。例如: 鰩科(Rajidae)的長吻鰩屬(Dipturus)魚類先聚為一支, 然后與鰩科的其他屬聚為一支; 無須鱈科(Merlucciidae)的無須鱈屬(Merluccius)和尖尾無須鱈屬(Macruronus)也聚為獨(dú)立的一支; 鲉形目(Scorpaeniformes)的兩種魚獨(dú)立聚為一支; 鱸形目(Perciformes )的鞍斑杜父鱸 ?與拉氏南美南極魚也獨(dú)立聚為一支。但目內(nèi)屬間的聚類出現(xiàn)一些異常, 鱸形目(Perciformes )烏魴、腹翼鯖分別與其他目的魚類先聚在一起。

3 討論

本文運(yùn)用COⅠ基因DNA序列標(biāo)記對我國西南大西洋遠(yuǎn)洋漁業(yè)的部分漁獲魚種的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步探討與分析。資料收集階段發(fā)現(xiàn)我國目前僅針對本國近海海域進(jìn)行魚類學(xué)相關(guān)研究, 但有關(guān)其他外海海域的魚類學(xué)相關(guān)資料極度匱乏, 魚類形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng)亟待補(bǔ)充與修訂。因此, 本研究中形態(tài)學(xué)鑒定主要依據(jù)文獻(xiàn)[11—14]等國外研究報(bào)道。但由于不同材料編纂角度有所區(qū)別,導(dǎo)致部分內(nèi)容出現(xiàn)分歧, 為避免形態(tài)學(xué)分類結(jié)果的不確定性, 本文從分子輔助分類的角度進(jìn)行一定程度的修正,保證了物種鑒定的準(zhǔn)確性。

圖2 基于14個(gè)物種的COⅠ序列單倍型構(gòu)建的鄰接關(guān)系樹Fig. 2 The neighbor-joining tree of 14 species resulted from haplotypes of CO Ⅰsequences

3.1 COⅠ條形碼鑒定存在的問題

自Hebert等[1]提出以COⅠ基因作為DNA條形碼以來,該基因在不同生物類群中應(yīng)用的有效性得到了越來越多的驗(yàn)證[6—10,19], 由此可見COⅠ基因在動(dòng)物條形碼應(yīng)用中具有一定的優(yōu)勢。其中COⅠ通用引物[6]的廣泛適用性在本研究中得到良好證明。本研究采用的通用引物對輻鰭魚綱10種及軟骨魚綱鰩科4種進(jìn)行擴(kuò)增, 均順利獲得相應(yīng)的序列(表1), 表明該通用引物在魚類物種中具有較普遍的適用性。

然而, COⅠ條形碼在鑒定物種過程中仍存在一定局限性。在確定物種的有效種名時(shí), ITIS分類系統(tǒng)與FishBase網(wǎng)站中關(guān)于編號Y3的記載出現(xiàn)分歧。根據(jù)樣本COⅠ序列與NCBI網(wǎng)站和BOLD系統(tǒng)的比對結(jié)果, 此物種的拉丁文名為Dipturus chilensis, 而FishBase網(wǎng)站中認(rèn)為此種與Zearaja chilensis為同種異名。比較發(fā)現(xiàn), Dipturus chilensis屬于長吻鰩屬(Dipturus), 而Zearaja chilensis為殼鰩屬(Zearaja)物種。為確定準(zhǔn)確的種名, 本研究根據(jù)種間遺傳距離進(jìn)行分析, Y3與本研究中阿根廷長吻鰩間的遺傳距離僅為0.0335, 且在N-J系統(tǒng)樹中, 兩者首先聚為一支, 因此判斷Y3為長吻鰩屬的一種。故選擇Dipturus chilensis為其有效種名。分析產(chǎn)生此類同種異名情況的原因: (1)缺乏足夠的樣本資料, 導(dǎo)致形態(tài)學(xué)鑒定出現(xiàn)偏差,命名錯(cuò)誤; (2)外形相似且物種間遺傳分化水平不高,COⅠ條形碼序列難于分辨[20]; (3)研究時(shí)間久遠(yuǎn), 鑒定方法不夠完善, 且后期研究結(jié)果未及時(shí)更新至數(shù)據(jù)庫。

3.2 COⅠ條形碼序列在系統(tǒng)進(jìn)化分析中的適用性

根據(jù)本研究COⅠ條形碼序列得到屬內(nèi)種間的遺傳距離為0.0335, 約為種內(nèi)遺傳距離(0.0028)的12倍, 這滿足了 Hebert等提出的“10×規(guī)則”, 即利用 COⅠ序列進(jìn)行有效物種鑒定的關(guān)鍵是種間遺傳距離必須大于種內(nèi)遺傳距離, 且距離差異大于10倍[8], 這也表明了COⅠ條形碼序列適用于物種鑒定的內(nèi)在特征。同時(shí), 通過本研究所得NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)分析得出, COⅠ條形碼序列不但可以進(jìn)行物種水平分類鑒定, 還可以用來進(jìn)行一定程度的系統(tǒng)進(jìn)化分析。但是, 由于COⅠ序列長度僅為650 bp左右,信息位點(diǎn)數(shù)目有限, 且科間變異較大, 堿基的轉(zhuǎn)換顛換比趨于飽和, 因此對于深入的系統(tǒng)進(jìn)化分析來講其參考價(jià)值不高。正如本文結(jié)果所示, 基于 COⅠ基因所建 NJ樹僅對屬內(nèi)階元具有較為準(zhǔn)確的辨識力, 而對于其他高級階元的準(zhǔn)確性明顯降低, 這與隨著其分類階元的升高,種間遺傳距離(K2P)的增值明顯減緩的趨勢相一致。

4 結(jié)論

研究認(rèn)為, 在形態(tài)學(xué)分類資料缺乏的情況下, COⅠ基因序列可以作為魚種鑒定的一種便捷有效的方式, 同時(shí)可以用來對魚類形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng)進(jìn)行補(bǔ)充和修訂。但是,COⅠ條形碼序列對種以上階元的物種鑒定存在其局限性。由于COⅠ基因的突變速率相對線粒體DNA控制區(qū)的要慢些[21], 因此若針對分化程度低的物種,選擇 Cytb或控制區(qū)可能更為有效。目前, 由于 COⅠ序列數(shù)據(jù)仍然有所欠缺, 本研究的拖網(wǎng)漁獲物中仍有一些物種未能進(jìn)行序列比對鑒定。因此, 為了更好地發(fā)揮 COⅠ基因序列在物種鑒定中的橋梁作用, COⅠ條形碼數(shù)據(jù)庫亟需完善,以求達(dá)到高質(zhì)量高庫容要求。與此同時(shí), 為突破 COⅠ條形碼序列的一些固有限制, 一方面要加強(qiáng)標(biāo)本的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)以及標(biāo)準(zhǔn)圖片的收集和整理, 另一方面應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充低分化物種的其他相關(guān)數(shù)據(jù)(如線粒體DNA控制區(qū)等)進(jìn)行更進(jìn)一步的分析。