孫海偉 習(xí)丙文 謝 駿,

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院, 無(wú)錫 210095; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無(wú)錫 214081)

放射孢子蟲(chóng)(Actinospore)是黏體動(dòng)物(Myxozoan)生活史中寄生在環(huán)節(jié)動(dòng)物(Anneild)宿主體內(nèi)的重要階段。自Stolc[1]在顫蚓(寡毛類(lèi))中首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道放射孢子蟲(chóng)以來(lái), 在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)放射孢子蟲(chóng)一直被認(rèn)為是與黏孢子蟲(chóng) (Myxospore) 親緣關(guān)系很近的獨(dú)立生物類(lèi)群, 并隸屬于黏體動(dòng)物門(mén)(Myxozoa)放射孢子蟲(chóng)綱(Actinosporea);同時(shí), 由于該類(lèi)群未曾發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)或社會(huì)影響, 相關(guān)的報(bào)道和研究非常稀少。然而, 1984年, Wolf 和Markiw[2]對(duì)有關(guān)虹鱒“旋轉(zhuǎn)病”(Whirling disease, WD)病原腦黏體蟲(chóng)(Myxobolus cerebralis)生活史的開(kāi)創(chuàng)性研究, 發(fā)現(xiàn)了腦黏體蟲(chóng)生活史存在魚(yú)和寡毛類(lèi)(Tubifex tubifex)兩個(gè)替換宿主(Alternative host), 放射孢子蟲(chóng)只是黏體動(dòng)物在寡毛類(lèi)宿主體內(nèi)的一個(gè)生活階段。此后, 有關(guān)放射孢子蟲(chóng)的研究日益增多和受到廣泛關(guān)注。在系統(tǒng)分類(lèi)上, Kent等[3]建議將此前的射孢子蟲(chóng)綱和黏孢子蟲(chóng)綱合并, 放射孢子蟲(chóng)綱作為黏孢子蟲(chóng)綱的同物異名而禁制使用, 但建議保留了原放射孢子蟲(chóng)綱 17個(gè)屬的名稱(chēng), 將其看作集合類(lèi)群(Collective group)用以描述和劃分具有相似形態(tài)特征的放射孢子蟲(chóng)。在魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)病害方面, 對(duì)發(fā)病水體放射孢子蟲(chóng)的調(diào)查和鑒定成為掌握黏孢子蟲(chóng)病感染、傳播的重要研究?jī)?nèi)容[4]。目前, 來(lái)自匈牙利、美國(guó)、日本等國(guó)家的學(xué)者已開(kāi)展了大量有關(guān)黏孢子蟲(chóng)病發(fā)生地區(qū)放射孢子蟲(chóng)區(qū)系調(diào)查, 報(bào)道了約 200余種類(lèi)型的放射孢子蟲(chóng)[4—6], 通過(guò)傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室感染方法鑒定出40余種魚(yú)體寄生黏孢子蟲(chóng)所對(duì)應(yīng)的寡毛類(lèi)寄生放射孢子蟲(chóng)[6]。

黏孢子蟲(chóng)是我國(guó)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)和野生魚(yú)類(lèi)資源重要的寄生蟲(chóng)病原, 已報(bào)道種類(lèi)約600余種[7]。其中一些種類(lèi)對(duì)我國(guó)魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖造成非常嚴(yán)重的危害, 如引起鯉魚(yú)腸道巨囊病的吉陶單極蟲(chóng)(Thelohanellus kitauei), 大量寄生在錦鯉鰓絲引起死亡的野鯉碘泡蟲(chóng)(Myxobolus koi), 引起草魚(yú)腸道糜爛的餅形碘泡蟲(chóng)(Myxobolus artus), 寄生在鯽魚(yú)咽部和肝臟引起大量死亡的洪湖碘泡蟲(chóng)(Myxobolus honghuensis)和吳李碘泡蟲(chóng)(Myxobolus wulii)等。然而, 我國(guó)黏孢子蟲(chóng)病的研究大多致力于種類(lèi)分類(lèi)、組織病理和流行病學(xué)和藥物防治[8—10]。有關(guān)黏孢子蟲(chóng)的感染、傳播、個(gè)體發(fā)生、生活史等缺乏詳細(xì)的研究, 特別是在黏孢子蟲(chóng)的放射孢子階段的研究報(bào)道屈指可數(shù)。在2000年, 王桂堂和姚衛(wèi)建[11]在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了一種三突放射孢子蟲(chóng)(Triactinomyxon)。此后, 翟艷花等[12,13]分別報(bào)道了2種放射孢子蟲(chóng)(Triactinomyxon和Raabeia); Xi等[14]報(bào)道了在池塘黏孢子蟲(chóng)調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的3種放射孢子蟲(chóng)(Raabeia, Aurantiactinomyxon和Guyenotia)。

在江蘇地區(qū)黏孢子蟲(chóng)病高發(fā)池塘放射孢子蟲(chóng)的區(qū)系調(diào)查過(guò)程中, 作者發(fā)現(xiàn)了多種放射孢子蟲(chóng)。本文描述一種Guyenotia 類(lèi)型放射孢子蟲(chóng)形態(tài)特征, 并通過(guò) 18S rDNA序列克隆和比對(duì)發(fā)現(xiàn)該Guyenotia放射孢子蟲(chóng)可能為一種魚(yú)體寄生楚克拉蟲(chóng)在蘇氏尾鰓蚓寄生發(fā)育階段所對(duì)應(yīng)的放射孢子蟲(chóng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2013年 5月中旬, 在江蘇常州地區(qū)一多年鯽魚(yú)養(yǎng)殖塘口, 用采泥器取塘底淤泥, 40目鋼篩篩除淤泥, 收集水蚯蚓。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

水蚯蚓的培養(yǎng) 將收集到的水蚯蚓帶回實(shí)驗(yàn)室, 將水蚯蚓分別轉(zhuǎn)移到稱(chēng)量瓶中, 每個(gè)稱(chēng)量瓶(50 mm×30 mm)中3—5條, 并加入約4 mL曝氣自來(lái)水, 室溫培養(yǎng)。

水蚯蚓 18S rDNA PCR擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)所用的提取DNA試劑盒為QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN)。切取水蚯蚓尾部一小段放入滅過(guò)菌的1.5 mL的離心管中, 按照說(shuō)明書(shū)的步驟依次進(jìn)行提取基因組 DNA。水蚯蚓 18S rDNA PCR擴(kuò)增所用引物為ERIB1 (ACCTGGTTGATCCT GCCAG)和 ERIB10 (CCTCCGCAGGTTCACCTACGG)[15]。PCR反應(yīng)條件為: 94℃ 預(yù)變性5min, 94℃變性30s, 52℃退火30s, 72℃延伸60s, 循環(huán)30次, 最后72℃末端加尾7min。

放射孢子蟲(chóng)的收集 每天在顯微鏡下觀察水體中是否有水蚯蚓釋放的放射孢子蟲(chóng), 一旦檢測(cè)到有放射孢子蟲(chóng), 將該組水蚯蚓進(jìn)一步單個(gè)培養(yǎng)在稱(chēng)量瓶中, 以確定釋放放射孢子蟲(chóng)的蚯蚓個(gè)體。在顯微鏡下觀察和記錄,并開(kāi)始收集有放射孢子蟲(chóng)的水樣, 直到蚯蚓不再釋放放射孢子蟲(chóng)為止, 每次收集到的水樣裝入 50 mL的離心管中, 放到–80℃的冰箱中保存起來(lái)。

放射孢子蟲(chóng)形態(tài)特征測(cè)量 在光學(xué)顯微鏡下觀察該放射孢子蟲(chóng)的形態(tài), 并用圖森TAC-9.0C顯微攝像進(jìn)行拍照; 用顯微鏡測(cè)微尺對(duì)放射孢子蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)量。

放射孢子蟲(chóng)18S rDNA PCR擴(kuò)增 將保存在–80℃的樣品取出融化后, 5000 r/min離心10min富集放射孢子蟲(chóng)?；蚪M提取同樣嚴(yán)格按QIAamp DNA Micro Kit 試劑盒說(shuō)明, 在加 Buffer AL 的時(shí)候提前加入 carrier RNA 1 ng。提取的基因組除一部分用于18S rDNA PCR 擴(kuò)增,其余部分放–20℃冰箱保存。放射孢子蟲(chóng)18S rDNA采用巢氏PCR 方法擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)所用外引物為ERIB1和ERIB10;內(nèi)引物為 Myxosp-F(TTCTGCCCTATCAACTW GTTG)和Myxosp-R(GGTTTCNCDGRGGGMCCAAC)[16]。PCR 反應(yīng)條件: 第一輪擴(kuò)增94℃ 預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 48℃退火45s, 72℃延伸90s, 循環(huán)30次; 72℃末端加尾7min;第二輪擴(kuò)增 94℃ 預(yù)變性 5min; 94℃變性 30s, 52℃退火30s, 72℃延伸60s, 循環(huán)30次; 72℃末端加尾7min。第一輪PCR時(shí), 所加的模板量為10 μL, 第二輪PCR時(shí)所加模板量為 3 μL。

PCR 反應(yīng)液的配制 10×PCR buffer (Mg2+) 5 μL;dNTP Mixture 4 μL; 正向引物(20 μm) 2 μL; 反向引物(20 μm)2 μL; Takara Ex Taq (5 U/μL) 0.5 μL; 補(bǔ)滅菌水至 50 μL。

序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳回收, 送上海生物工程有限公司測(cè)序。獲得的18S rDNA 的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST檢索同源性序列。序列多重比對(duì)使用Clustal X軟件[17], 序列間的一致性分析使用MEGA 4.0 軟件[18]。為了分析放射孢子集合類(lèi)群與黏孢子蟲(chóng)類(lèi)群間是否存在對(duì)應(yīng)關(guān)系, 通過(guò)檢索GenBank中登錄的放射孢子蟲(chóng)序列, 并Blast比對(duì)和下載相似性最高的黏孢子蟲(chóng)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育分析在 MEGA4.0[18]軟件中采用最小進(jìn)化法(Minimum Evolution)、最大似然法(Maximum Likelihood),分支置信度用Bootstrap自展檢驗(yàn)1000次。

2 結(jié)果

2.1 水蚯蚓的鑒定

在調(diào)查中采集到的水蚯蚓在蟲(chóng)體后部具有絲狀的鰓。這一形態(tài)特征是環(huán)節(jié)動(dòng)物寡毛類(lèi)尾鰓蚓典型特征。PCR擴(kuò)增獲得水蚯蚓18S rDNA 序列片段長(zhǎng)度為1803 bp。序列比對(duì)分析表明該水蚯蚓與 GenBank 中的蘇氏尾鰓蚓(Branchiura sowerbyi)(DQ459985)的序列一致性最高(99.8%)。因此可以鑒定該水蚯蚓為蘇氏尾鰓蚓。

2.2 放射孢子蟲(chóng)鑒定

放射孢子蟲(chóng)的檢測(cè) 通過(guò)連續(xù) 2周的顯微鏡檢查, 在采集到的400條水蚯蚓中僅檢查到1條釋放出本文報(bào)道的放射孢子蟲(chóng), 感染率為0.25%。蘇氏尾鰓蚓每天釋放放射孢子蟲(chóng)的高峰出現(xiàn)在下午。

放射孢子蟲(chóng)的形態(tài)特征 檢查到的放射孢子蟲(chóng)呈Guyenotia集合類(lèi)群的典型特征。孢體呈球形, 無(wú)孢柄, 極囊呈三個(gè)點(diǎn)狀緊簇的位于胞體頂部, 三個(gè)尾柄呈指狀且末端較鈍, 尾柄核近尾柄末端。孢體長(zhǎng) 10.7 μm (10.0—12.1); 極囊 1.8 μm (1.7—2.0); 尾柄長(zhǎng) 20.5 μm (17.4—23.8), 寬5.8 μm (4.8—6.3)。為了便于區(qū)別該類(lèi)群其他放射孢子蟲(chóng), 作者根據(jù)目前慣例將其命名為 Guyenotia type CZ (圖 1、圖 2)。

表1 本文描述放射孢子蟲(chóng)與文獻(xiàn)報(bào)道中相似放射孢子蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)比較Tab. 1 Comparison of measurements of the newly identified and the known Guyenotia types reported in scientific literatures

圖1 Guyenotia type CZ放射孢子蟲(chóng)的整體形態(tài)(標(biāo)尺=10 μm)Fig. 1 Morphology of the Guyenotia type (Scale bar = 10 μm)

圖2 Guyenotia type CZ放射孢子蟲(chóng)的側(cè)面觀(標(biāo)尺=10 μm)Fig. 2 Lateral view of the Guyenotia type (Scale bar = 10 μm)

18S rDNA 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR擴(kuò)增獲得的放射孢子蟲(chóng)18S rDNA 序列為935 bp(GenBank 登錄號(hào)為 KF912153)。NCBI中 BLAST比對(duì)分析顯示本報(bào)道的 Guyenotia放射孢子蟲(chóng) 18S rDNA 序列與兩極科(Myxidiidae)的楚克拉屬(Zschokkella)和兩極蟲(chóng)屬(Myxidium)的孢子蟲(chóng), 以及球孢科(Sphaerosporidae)的Sphaerospora sp.(AY735411)具有較高遺傳相似性。其中,Guyenotia type CZ2013與GenBank中的Zschokkella sp.(DQ118776)、Sphaerospora sp. (Eszterbauer, et al.[22]AY735411)和放射孢子蟲(chóng) Guyenotia (Eszterbauer, et al.[21]AY779063)的序列一致性最高, 分別為 98.2%、98.1%、97.7%。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中(圖 3), 本文報(bào)道的 Guyenotia type CZ 與 Zschokkella sp. (DQ118776)、Guyenotia (AY779063)穩(wěn)定的聚為一個(gè)分支。

3 討論

自 Wolf 和 Markiw[2]首次證實(shí)放射孢子蟲(chóng)是黏孢子蟲(chóng)一個(gè)早期形態(tài)階段后, 這個(gè)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)被大家所認(rèn)可,并陸續(xù)被研究者報(bào)道; 到目前為止報(bào)道的放射孢子蟲(chóng)有200多種(17個(gè)組合群)。在放射孢子蟲(chóng)類(lèi)群的鑒定中, 孢體的形狀、孢柄的有無(wú)、尾柄在胞體后發(fā)生位置和尾柄形狀都是非常重要的鑒定特征。本文描述的放射孢子蟲(chóng)(圖1、圖 2)孢子體呈球形, 極囊呈三個(gè)點(diǎn)狀緊簇的位于胞體頂部, 尾柄呈三個(gè)指狀且末端較鈍, 尾柄核近尾柄末端,這些形態(tài)特征為Guyenotia類(lèi)群的典型特征, 因此將該放射孢子蟲(chóng)劃歸為該集合類(lèi)群。通過(guò)形態(tài)特征比較, 本文報(bào)道的放射孢子蟲(chóng)與文獻(xiàn)中已報(bào)道Guyenotia類(lèi)群的放射孢子蟲(chóng)同時(shí)存在以下形態(tài)差異: (1)寄生宿主不同, 表1中所報(bào)道的放射孢子蟲(chóng)的宿主多為正顫蚓、夾雜帶絲蚓這 2種寡毛類(lèi)動(dòng)物, 而本文報(bào)道的放射孢子蟲(chóng)的宿主為蘇氏尾鰓蚓。(2)形態(tài)大小有差異, 如表1中 Eszterbauer等[20]所報(bào)道的 Guyenotia 類(lèi)型放射孢子蟲(chóng)的尾突長(zhǎng)度為15—21 μm, 寬度為 3.5—5.5 μm, 孢子體長(zhǎng)度為 9.5—12 μm,極囊為1.3—2 μm; Xiao等[19]所報(bào)道的Guyenotia 類(lèi)型放射孢子蟲(chóng)的尾突長(zhǎng)度為21 μm寬度為4.5—6.4 μm, 孢子體長(zhǎng)度為9.5 μm, 極囊為3 μm。從這些數(shù)據(jù)上可以看出與本文所描述的放射孢子蟲(chóng)有差別。(3)本文報(bào)道的放射孢子蟲(chóng)的極囊占孢子體的比例與 Eszterbauer等[21]報(bào)道的Guyenotia類(lèi)型的放射孢子蟲(chóng)的差異明顯, 后者的極囊/孢子體要小于本文報(bào)道的, 雖然整體形狀都?xì)w為同一類(lèi)群,但是極囊占孢子體的位置也有很大的區(qū)別, 比如后者極囊排列緊密。本文報(bào)道的放射孢子蟲(chóng)與 Xi等[14]報(bào)道的Guyenotia放射孢子蟲(chóng)在形態(tài)、個(gè)體大小和宿主非常相似,可能為同一種放射孢子蟲(chóng)。然而, 由于放射孢子蟲(chóng)的形態(tài)特征非常簡(jiǎn)單, 僅僅依據(jù)形態(tài)很難做出準(zhǔn)確的鑒定[20]。此外, Xi等[14]報(bào)道的 Guyenotia放射孢子蟲(chóng)由于沒(méi)有提供DNA序列, 本文也無(wú)法通過(guò)分子序列對(duì)其進(jìn)行比較分析。

作者在比較GenBank中Sphaerospora sp. (AY735411)(采集自鯽魚(yú)腎小管), 和 Zschokkela sp. (DQ118776)(采集自鯽魚(yú)膽管)的序列時(shí)發(fā)現(xiàn)這2個(gè)來(lái)自不同黏孢蟲(chóng)科的孢子蟲(chóng)18S rDNA序列完全一致。在Fiala[23]構(gòu)建的黏孢子蟲(chóng) 18S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中(見(jiàn)文章中 Fig. 5),Sphaerospora sp. (AY735411)單個(gè)聚類(lèi)在整個(gè)兩極科大分支中。因此, 作者傾向于認(rèn)為 Eszterbauer 和 Szekely[22]在GenBank中登錄的Sphaerospora sp. 序列(AY735411)可能由于采樣過(guò)程樣品污染, 或組織同時(shí)感染有 2種黏孢子蟲(chóng)導(dǎo)致出現(xiàn)的錯(cuò)誤; Zschokkella sp. (DQ118776)的鑒定和DNA測(cè)序結(jié)果應(yīng)該是正確的。Eszterbauer等[21]在運(yùn)用18S rDNA 序列鑒定放射孢子蟲(chóng)Guyenotia (AY779063)時(shí)也注意到該放射孢子蟲(chóng)與Sphaerospora sp. (AY735411)和Zschokkella sp. (DQ118776)的序列一致性分別為100%和99.9%。

在黏孢子蟲(chóng)種類(lèi)鑒定中, 不同種的種內(nèi)18S rDNA序列差異沒(méi)有統(tǒng)一界限, 種內(nèi)差異通常在1%—3%[24—26]。本文報(bào)道的Guyenotia type CZ 與楚克拉(Zschokkella sp.DQ118776)的序列一致性為98.2%, 系統(tǒng)發(fā)育分析中其與兩極科楚克拉屬聚為一支, 因此, 作者認(rèn)為Guyenotia type CZ應(yīng)屬于楚克拉屬(Zschokkella )的黏孢子蟲(chóng)在蘇氏尾鰓蚓寄生階段所對(duì)應(yīng)的放射孢子蟲(chóng)。

自 Kent等[3]廢止射孢子蟲(chóng)綱類(lèi)群有效后, 放射孢子蟲(chóng)綱下原有的屬名被以集合類(lèi)群(Collective group)形式保留, 用于描述和劃分具有相似形態(tài)特征的放射孢子蟲(chóng)。目前, 發(fā)現(xiàn)不同水體中的放射孢子和鑒定其所對(duì)應(yīng)的魚(yú)體寄生黏孢子蟲(chóng)種類(lèi)引起寄生蟲(chóng)學(xué)和魚(yú)病學(xué)研究人員廣泛關(guān)注。然而, 根據(jù)本文構(gòu)建的放射孢子蟲(chóng)和黏孢子蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 放射孢子蟲(chóng)的集合類(lèi)群和黏孢子蟲(chóng)各屬間沒(méi)有呈現(xiàn)清晰的對(duì)應(yīng)關(guān)系。如與碘泡屬(Myxobolus)的黏孢子蟲(chóng)存在對(duì)應(yīng)關(guān)系的放射孢子蟲(chóng)類(lèi)群有 Triactinomyxon、Aurantiactinomyxon、Raabeia、Hexactinomyxon等。因此,從放射孢子蟲(chóng)形態(tài)特征去推斷其歸屬于某個(gè)黏孢子蟲(chóng)屬種類(lèi)沒(méi)有規(guī)律可循。放射孢子蟲(chóng)的鑒定需要通過(guò)傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室感染或DNA分子序列分析。實(shí)驗(yàn)室感染通常耗時(shí)較長(zhǎng), 而分子鑒定較為快速、便捷和準(zhǔn)確。