宋 蓓 康熙雄** 牛靖萱 王 英 張錫林

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心，北京 100050; 2.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病原生物學(xué)教研室，重慶 400038)

半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase)是一類(lèi)含半胱氨酸殘基的蛋白水解酶,廣泛存在于人類(lèi)、寄生動(dòng)物等多種動(dòng)物體內(nèi)(Parketal.,2002)。該蛋白酶除可作為一些寄生蟲(chóng)的免疫優(yōu)勢(shì)抗原外,還與蟲(chóng)體的入侵、免疫逃避以及蟲(chóng)株毒力等密切相關(guān)(王利芳等，2010)。我們從2-DE實(shí)驗(yàn)獲得斯氏并殖吸蟲(chóng)Pagumogonimusskrjabini與免疫診斷相關(guān)的蟲(chóng)體蛋白(P.skrjabiniMetacercaria 01，PsMt 01)(牛靖萱等，2010)，與半胱氨酸蛋白酶酶類(lèi)相關(guān)。本研究采用qRT-PCR技術(shù)，研究PsMt 01 mRNA在斯氏并殖吸蟲(chóng)不同蟲(chóng)期的表達(dá)，探討其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1斯氏并殖吸蟲(chóng)囊蚴：采集四川省興文縣斯氏并殖吸蟲(chóng)病流行區(qū)的鋸齒華溪蟹Sinopotamondenticulatum，從中分離出斯氏并殖吸蟲(chóng)的囊蚴。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠16只(體重150～200 g、雌雄不限)、雄性家犬購(gòu)自于第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.3并殖吸蟲(chóng)囊蚴感染動(dòng)物：將SD大鼠分為4組，每組4只，分別腹腔注射50/只囊蚴。分別在3、7周，檢獲幼蟲(chóng)、童蟲(chóng)。雄性家犬經(jīng)腹腔注射感染(200個(gè)囊蚴/條)，感染后90 d剖殺，從肺部檢獲成蟲(chóng)和蟲(chóng)卵。

1.2 試劑

Trizol試劑盒購(gòu)于Bio Basic公司，qRT-PCR Kit(Perfect Real Time)購(gòu)于大連寶生物公司。根據(jù)qRT-PCR引物設(shè)計(jì)要求，由上海賽百盛公司設(shè)計(jì)并合成引物。PsMt 01上游引物5′-AGGCGGCGTGCTCCTCCTCATA-3′，PsMt 01下游引物5′-TGGTTCGTGTTGGGCGTTCTCG-3′；18S上游引物5′-GGCATTTGTATGGCGGTGTT-3′，18S下游引物5′-GATCGTCAGTTGGCATC GTTTAT-3′。

1.3 方法

1.3.1RNA提?。簯?yīng)用Trizol試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)要求分別提取斯氏并殖吸蟲(chóng)的蟲(chóng)卵、囊蚴、幼蟲(chóng)、童蟲(chóng)、成蟲(chóng)的總RNA。以Nano Drop ND 1000微量紫外分光光度儀檢測(cè)總 RNA 濃度。

1.3.2cDNA合成：應(yīng)用東洋紡公司高效率逆轉(zhuǎn)錄試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace-α合成cDNA。(1)RNA變性：總RNA 1 μL(<1 ng/μL)，RNase Free H2O 10 μL，Primer 1 μL，65 ℃ 水浴5 min，取出立刻冰上靜置。(2)cDNA合成：變性RNA 12 μL，5×RT Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，RNase 1 μL，Rever TraAce 1 μL。30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。產(chǎn)物瞬時(shí)離心，Nano Drop 1000紫外分光光度儀檢測(cè)cDNA質(zhì)量。

1.3.3PsMt01 cDNA模板梯度稀釋?zhuān)喝?.5 μL的PsMt01 cDNA 模板加入1.5 μL的EASY Dilution稀釋液管中，按照操作說(shuō)明進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)玫?×10-4～1×100的PsMt01基因質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。

1.3.4qRT-PCR：取蟲(chóng)卵、囊蚴、幼蟲(chóng)、童蟲(chóng)、成蟲(chóng)的cDNA分別進(jìn)行PsMt 01和18S 的SYBR Green I熒光定量PCR。每份標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)PsMt 01和18S，同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品組。按照TOYOBO反應(yīng)試劑盒進(jìn)行：SYBR 12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，模板1 μL，無(wú)菌水加至總體積25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,數(shù)據(jù)分析軟件將樣本的擴(kuò)增曲線(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比,并結(jié)合內(nèi)參自動(dòng)計(jì)算出各樣本的mRNA的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 RNA及cDNA質(zhì)量鑒定

總RNA電泳顯示可見(jiàn)較清晰的3條帶，即為5S、18S、28S，表明提取的總RNA無(wú)降解，完整性和均一性較好(圖1)。Naro Drop 1000紫外分光光度儀檢測(cè)總RNA和cDNA，OD260/OD280均大于1.80。

圖1 總RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Total RNA separated by 1% agarose gel electrophoresis

2.2 各個(gè)蟲(chóng)期qRT-PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

分別取5 μL各蟲(chóng)期qRT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)qRT-PCR產(chǎn)物擴(kuò)增成功(圖2-A)。結(jié)果顯示該P(yáng)sMt 01蛋白在蟲(chóng)卵期沒(méi)有表達(dá)，但表達(dá)在從囊蚴期到成蟲(chóng)期，最高的表達(dá)量在0～7周的幼蟲(chóng)期和童蟲(chóng)期，這個(gè)階段是寄生蟲(chóng)在宿主體內(nèi)遷移活躍階段。成蟲(chóng)期表達(dá)量較少。內(nèi)參(18S)基因作為質(zhì)控，檢測(cè)cDNA生物質(zhì)量(圖2-B)，在蟲(chóng)體發(fā)育的各個(gè)時(shí)期持續(xù)表達(dá)。

圖2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Transcription profile PsMt 01 in the developmental stagesA：PsMt 01蛋白不同時(shí)期的表達(dá)； B：18S.1:DNA marker DL2000;2:蟲(chóng)卵期;3:囊蚴期;4:幼蟲(chóng)期;5:童蟲(chóng)期;6:成蟲(chóng)期。A.PsMt 01 gene；B.18S.1：DNA marker DL2000；2：Egg； 3： Metacercaria； 4： Larva-5w； 5.Larva-7w； 6.Adult.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

將PsMt 01基因質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10倍梯度稀釋同時(shí)進(jìn)行定量PCR。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是將各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的起始拷貝數(shù)取對(duì)數(shù)作為縱坐標(biāo)，其所對(duì)應(yīng)的循環(huán)閩值(Threshold cycle value，Ct)作為橫坐標(biāo)，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖3)。圖中標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好回歸系數(shù)R2=0.994，線(xiàn)性關(guān)系較好，說(shuō)明定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)能準(zhǔn)確反映待檢樣品的起始核酸量。

圖3 PsMt01質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.3 Standard curve for PsMt01 gene

2.4 溶解曲線(xiàn)

熒光染料在反應(yīng)末尾對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解，溶解峰反映擴(kuò)增產(chǎn)物的量。圖4為標(biāo)準(zhǔn)品的溶解曲線(xiàn)，圖示溶解曲線(xiàn)良好，背景干凈，所有曲線(xiàn)只有一個(gè)主峰并且在相同的溫度之間，說(shuō)明引物的特異性高，擴(kuò)增產(chǎn)物單一特異。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品溶解曲線(xiàn)Fig.4 Standard molten curve

2.5 qRT-PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

圖5-A、5-B所示，擴(kuò)增曲線(xiàn)平滑，熒光量的增長(zhǎng)曲線(xiàn)符合標(biāo)準(zhǔn)“S”型，每條曲線(xiàn)均有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期，基線(xiàn)平、無(wú)上揚(yáng)，不同的標(biāo)準(zhǔn)起始模板數(shù)在反應(yīng)后的平臺(tái)期，產(chǎn)物量相差不大。曲線(xiàn)與曲線(xiàn)間平行性較好，說(shuō)明各反應(yīng)管擴(kuò)增效率相近，定量的重復(fù)性和準(zhǔn)確性較好。

2.6 PsMt 01在不同蟲(chóng)期的表達(dá)

圖5 PsMt 01基因擴(kuò)增曲線(xiàn)Fig.5 Amplification curves of 18S gene and PsMt 01A.18S基因; B.PsMt基因。A.18S gene; B.PsMt 01 gene.

圖6 斯氏并殖吸蟲(chóng)PsMt 01表達(dá)趨勢(shì)圖Fig.6 Pagumogonimus skrjabini PsMt 01 expression trends1：蟲(chóng)卵期； 2：囊蚴期；3：幼蟲(chóng)期； 4：童蟲(chóng)期； 5：成蟲(chóng)期。1:Egg; 2: Metacercaria; 3:Larva-5w; 4:Larva-7w; 5: Adult.

qRT-PCR儀器自帶軟件生成PsMt 01表達(dá)圖譜顯示：與校正樣品(18S)相比PsMt 01(目的基因)的基因表達(dá)水平(圖6)。圖中顯示，PsMt 01 mRNA主要表達(dá)在囊蚴期(39.34±0.26)，幼蟲(chóng)期(42.56±0.35)及童蟲(chóng)期(44.12±0.56)，并且是逐步升高趨勢(shì)，成蟲(chóng)期(27.64±0.77)表達(dá)較少，蟲(chóng)卵期沒(méi)有表達(dá)。

3 討論

qRT-PCR技術(shù)通過(guò)檢測(cè)各種組織細(xì)胞中基因表達(dá)豐度來(lái)分析該基因的表達(dá)調(diào)控，并可監(jiān)控其mRNA的表達(dá)模式。目前，qRT-PCR主要用于檢測(cè)組織中含量較少的基因，對(duì)不同組織中基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析。近期，有學(xué)者采用實(shí)時(shí)熒光共振能量轉(zhuǎn)移PCR(real-time FRET PCR)以解鏈曲線(xiàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染貓糞便的異盤(pán)并殖吸蟲(chóng)Paragonimusheterotremus蟲(chóng)卵，最低可檢出每克被異盤(pán)并殖吸蟲(chóng)感染貓糞便中含有10 個(gè)蟲(chóng)卵。該方法能用于異盤(pán)并殖吸蟲(chóng)感染情況的檢測(cè)和流行病學(xué)研究(Tantrawatpanetal.2013)。本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)PsMt 01 mRNA在斯氏并殖吸蟲(chóng)不同蟲(chóng)期(蟲(chóng)卵、囊蚴、幼蟲(chóng)、童蟲(chóng)、成蟲(chóng))的表達(dá)進(jìn)行研究，通過(guò)分析PsMt 01 mRNA在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)變化情況，推斷PsMt 01蛋白在蟲(chóng)體發(fā)育時(shí)期的生理學(xué)功能。

PsMt 01是本實(shí)驗(yàn)室從2-DE實(shí)驗(yàn)獲得蛋白，經(jīng)De Novo肽測(cè)序分析主要與半胱氨酸蛋白酶酶類(lèi)相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，哺乳動(dòng)物半胱氨酸蛋白酶的研究主要集中在凋亡機(jī)制方面。半胱氨酸蛋白酶作為寄生蟲(chóng)主要的消化酶，在維護(hù)寄生蟲(chóng)本身細(xì)胞生理及功能上起著重要的作用，通過(guò)降解宿主組織、攝取營(yíng)養(yǎng)和免疫逃避來(lái)維持在宿主體內(nèi)的寄生，在寄生蟲(chóng)的生存及與宿主的相互關(guān)系上具有重要的作用 (Moncadaetal.，2003)，涉及蟲(chóng)體的毒力、對(duì)組織和細(xì)胞的侵襲力以及免疫逃避等多個(gè)方面(Kangetal.，2010)。在自由生活阿米巴中,致病株(如卡伯特森氏棘阿米巴)較非致病株具有更高的半胱氨酸蛋白酶活性,由此推斷在寄生蟲(chóng)感染的致病機(jī)制中半胱氨酸蛋白酶起著重要的作用(Dixitetal.，2008)。本研究qRT-PCR結(jié)果表明：PsMt 01 mRNA在蟲(chóng)卵期尚未表達(dá)，至囊蚴期表達(dá)為39.34±0.26，幼蟲(chóng)期為42.56±0.35，其表達(dá)量隨發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)逐步升高趨勢(shì)，至童蟲(chóng)期達(dá)到峰值44.12±0.56，在成蟲(chóng)期表達(dá)減低為27.64±0.77。PsMt 01 mRNA表達(dá)量在0～7 周的幼蟲(chóng)期和童蟲(chóng)期最高，此階段是斯氏并殖吸蟲(chóng)在宿主體內(nèi)遷移活躍時(shí)期。因此推斷PsMt 01蛋白在蟲(chóng)體發(fā)育的早期發(fā)揮著重要作用，可能與免疫逃避和組織遷移等活動(dòng)相關(guān)。

近年來(lái)，寄生蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶得到了越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注(Shareefetal.，2014)。本研究從基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)半胱氨酸蛋白酶在不同蟲(chóng)期的表達(dá)水平進(jìn)行研究，探討闡述其生物學(xué)功能。不僅有助于揭開(kāi)寄生蟲(chóng)與宿主相互作用的機(jī)制，也為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。