陳 健，呂新勇，孫曉萍，陳春苗，周 軍，王振中，蕭 偉

(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室江蘇省企業(yè)院士工作站，江蘇連云港 222001)

偏頭痛是人類最常見的慢性疾病之一，其作用機制尚不明確。目前，對偏頭痛的研究分為3種學(xué)說，尤以神經(jīng)源性炎癥學(xué)說得到廣泛認(rèn)可［1－4］。腦部血管擴張是引發(fā)偏頭痛的關(guān)鍵［5］，研究表明［6－9］，電刺激大鼠硬腦膜可以引起腦部三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致血流量增加，形成電刺激硬腦膜偏頭痛動物模型。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene－related peptide，CGRP)和血管活性物質(zhì) P物質(zhì)，一直被視為偏頭痛發(fā)作時，神經(jīng)纖維釋放的重要的肽類物質(zhì)，其中CGRP為偏頭痛發(fā)作時腦及硬腦膜血管擴張物質(zhì)，P物質(zhì)為主要鎮(zhèn)痛因子，二者參與發(fā)病機制的整個過程［10］。前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)作為一種炎癥因子，具有擴張血管，增加血流量的作用，但對于其參與頭痛的發(fā)病機制研究，一直鮮有報道。Ebersberger等［11］通過對離體大鼠硬腦膜的順/逆電刺激及化學(xué)刺激發(fā)現(xiàn)，PGE2可以促進(jìn)腦膜傷害感受器激發(fā)而產(chǎn)生疼痛。本實驗動物模型在國內(nèi)外均有報道，國內(nèi)學(xué)者對于模型刺激參數(shù)的研究表明，刺激頻率是影響模型成功與否的關(guān)鍵因素［12］。實驗前期，分別采用了20和3 Hz進(jìn)行預(yù)試，結(jié)果表明，頻率過大，易導(dǎo)致大鼠硬腦膜的擊穿，造成大鼠死亡;頻率過小，刺激時間相應(yīng)增加，延長實驗周期，同時降低造模的成功率。因此，本研究選擇刺激大鼠腦部上矢狀竇區(qū)硬腦膜，頻率6 Hz，刺激時間1 h，并在刺激0，15，30 min和1 h對大鼠進(jìn)行眼眶采血，1 h后取大鼠腦組織，通過對血漿和腦組織中CGRP、P物質(zhì)和PGE2檢測，確定電刺激過程中，大鼠外周靜脈血中CGRP、P物質(zhì)和PGE2釋放的動態(tài)變化及全腦中含量差異。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

0.9%生理鹽水100 mL注射液(山東潔晶藥業(yè)有限公司，批號:101111423)，異氟烷(山東新時代藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號 20110604)，水合氯醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號:20100304)，肝素鈉(效價 ＞170 kU·g－1，上海 SCRC630071國藥集團)，義齒基托樹脂(Ⅱ型自凝型)每瓶100 mL(上海二醫(yī)張江生物材料有限公司，批號:120409)，注射用青霉素鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號L111102)。CGRP、P物質(zhì)和PGE2放免疫試劑盒(北京華英生物有限公司，生產(chǎn)批號20130610)。

r－911全自動放免計數(shù)儀(中國科技大學(xué)實業(yè)總公司生產(chǎn))，68006雙臂腦立體定位儀，臺式牙科鉆(深圳市瑞沃德科技有限公司生產(chǎn))，Medlab－v/8c生物信號采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)，BS224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，5804R Eppendorf冷凍離心機，MIDMARL 91805112氣體麻醉機。

1.2 動物及分組處理

18只SD健康雄性大鼠，體質(zhì)量400～450 g，SPF級，遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK2010－0001。SD大鼠隨機分為3組，每組6只，即正常對照組、手術(shù)對照組和模型組。

除正常對照組大鼠外，其余大鼠ip給予1 mL青霉素鈉(80萬單位/5 mL，0.9%生理鹽水配制)，ip給予10%水合氯醛麻醉。以大鼠腦部十字縫交叉點前4 mm和交叉點后6 mm，分別用臺式牙科鉆鉆開2個直徑約1 mm的圓孔，在上下2個圓孔中打入1 mm×3 mm圓頭螺釘，顱面干燥后，用齒科粉和義齒基托樹脂(Ⅱ型自凝型)將螺釘以及導(dǎo)線固定于大鼠顱骨表面，干凝后，涂撒青霉素，導(dǎo)線于皮外留出8 mm左右備用。術(shù)后2 d ip給予青霉素鈉。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.3 大鼠腦部電刺激及血樣、腦組織采集

術(shù)后第3天，模型組大鼠經(jīng)氣體麻醉機麻醉，行電壓3 V、頻率6 Hz、脈寬0.25 ms、時間1 h電刺激，并于刺激0，15和30 min以及1 h時進(jìn)行大鼠眼眶采血，用肝素管收集約1 mL全血，并置于冷凍離心機中進(jìn)行離心(4℃，2862×g離心10 min)，取上層血漿;1 h后取模型組大鼠腦組織，與血漿共同置于－20℃冰箱中保存。正常對照組和手術(shù)對照組大鼠麻醉后均在相應(yīng)的時間點取血和腦組織。

1.4 放射免疫法檢測CGRP、P物質(zhì)和PGE2含量

每1 mL血漿加2 mL冷丙酮(4℃)，混勻，4℃下2862×g離心20 min)。取上清加4 mL冷石油醚，混勻后再次離心。吸棄上相，下相用氮氣吹干后干燥密封，待測。取大小適宜的組織塊，立即稱重于煮沸的生理鹽水(1 mL)中煮沸3 min再加0.5 mL冰醋酸1 mol·L－1于勻漿器中勻漿提取，再用0.5 mL NaOH 1 mol·L－1中和，2862 × g 離心15 min。取上清液儲存于－20℃待測。使用r－911全自動放免計數(shù)儀以及放射免疫試劑盒，對血漿及腦組織樣本進(jìn)行CGRP、P物質(zhì)和PGE2檢測。

1.5 實驗數(shù)據(jù)結(jié)果用±s表示，采用 SPSS10.7軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 電刺激上矢狀竇區(qū)硬腦膜對大鼠血漿及腦組織CGRP含量的影響

表1結(jié)果顯示，正常對照組、手術(shù)對照組和模型組大鼠眼眶血漿中CGRP在各時間點含量無顯著性差異。正常對照組和手術(shù)對照組大鼠腦組織CGRP含量相近，相比模型組大鼠腦組織CGRP含量顯著上升(P＜0.05)。

2.2 電刺激上矢狀竇區(qū)硬腦膜對大鼠血漿及腦組織P物質(zhì)含量的影響

與手術(shù)對照組比較，正常對照組和模型組大鼠眼眶血漿中P物質(zhì)含量無顯著性差異;而在腦組織中，與手術(shù)對照組相比，模型組大鼠P物質(zhì)含量最低(P ＜0.05)(表2)。

2.3 電刺激上矢狀竇區(qū)硬腦膜對大鼠血漿及腦組織PGE2含量的影響

與手術(shù)對照組相比，正常對照組和模型組大鼠各時間點血漿中PGE2含量均無顯著性差異;模型組大鼠腦組織中PGE2含量高于正常對照組和手術(shù)對照組大鼠，且與手術(shù)對照組相比，有顯著性差異(P ＜0.05)(表3)。

Tab.1 Content of calcitonin gene－related peptide(CGRP)in plasma and brain of rats with electrical stimulation of dura mater of superior sagittal sinus

Tab.2 Content of P substance in plasma and brain of rats with electrical stimulation of dura mater of superior sagittal sinus

Tab.3 Content of prostaglandin E2(PGE2)in plasma and brain of rats with electrical stimulation of dura mater of superior sagittal sinus

3 討論

本研究數(shù)據(jù)顯示，模型組大鼠靜脈血漿中CGRP、P物質(zhì)以及PGE2含量隨時間變化先上升后下降，腦組織中CGRP和 PGE2的含量最高，P物質(zhì)的含量最低，表明腦部電極植入術(shù)未對實驗產(chǎn)生影響。

軟腦膜與硬腦膜血管收縮舒張為痛覺信號傳輸?shù)膩碓矗嫔窠?jīng)為偏頭痛發(fā)作時疼痛傳入神經(jīng)。盡管引發(fā)疼痛的機制尚不完全清楚，但是已知很多化學(xué)物質(zhì)參與其中［13］，它們共同激活三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)引發(fā)疼痛，導(dǎo)致血管中神經(jīng)肽類和炎癥因子等的釋放，其中主要的神經(jīng)肽即為CGRP和P物質(zhì)。

外周血漿中P物質(zhì)產(chǎn)生的變化，根據(jù)Goadsby等［14］和 Zagami等［15］研究分別顯示，在電刺激貓的三叉神經(jīng)節(jié)時，P物質(zhì)可以增加釋放量，而刺激上矢狀竇區(qū)硬腦膜時，P物質(zhì)含量卻基本沒有改變。Edvinsson等［16］通過腦膜以及血管中P物質(zhì)釋放研究發(fā)現(xiàn)對軟腦膜的電刺激和化學(xué)刺激可以引起P物質(zhì)釋放。因此，結(jié)合本實驗數(shù)據(jù)結(jié)果綜合分析，在僅刺激硬腦膜時，外周血漿中P物質(zhì)釋放可能無法顯著性增加。

CGRP在外周血漿整個釋放過程中可能亦是如此。CGRP一直被認(rèn)為是偏頭痛病理生理學(xué)研究的基礎(chǔ)，是一種強有力的舒張血管的肽類物質(zhì)。根據(jù)對離體大鼠硬腦膜電刺激實驗結(jié)果表明［14］，隨著腦部電刺激進(jìn)行，CGRP的釋放持續(xù)增加;對大鼠進(jìn)行三叉神經(jīng)節(jié)電刺激［17］，大鼠外周血中CGRP的含量也顯著增加。但董釗等［18］通過對大鼠上矢狀竇旁硬腦膜行電刺激后，進(jìn)行心臟取血，并對血漿中CGRP和P物質(zhì)采用放射免疫法檢測，結(jié)果電刺激降低大鼠血漿CGRP濃度，初步推測采血樣的時機可以影響測定結(jié)果。Vessei等［19］也通過對CGRP作用的研究分析發(fā)現(xiàn)，血樣的采集時間是影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵。本研究采用對大鼠腦部電刺激過程中，按不同時間點對大鼠眼眶進(jìn)行連續(xù)采血，對血漿中CGRP、P物質(zhì)和PGE2的含量隨著刺激時間的不同，進(jìn)行含量變化檢測，避免了采血時機對物質(zhì)含量測定的影響。

Brain等［20］通過P物質(zhì)對CGRP血管舒張活性的調(diào)節(jié)研究發(fā)現(xiàn)，P物質(zhì)釋放變化可能影響CGRP的含量，升高的P物質(zhì)可以激活肥大細(xì)胞產(chǎn)生蛋白酶從而水解釋放的CGRP，達(dá)到降低腦部血管擴張作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中，CGRP的含量顯著升高，P物質(zhì)的含量顯著降低，間接對這一推斷進(jìn)行了佐證。

Ebersberger等［11］通過電刺激離體大鼠硬腦膜首次發(fā)現(xiàn)，腦膜組織中PGE2的釋放，并根據(jù)其隨刺激時間的變化推斷PGE2需要在CGRP等神經(jīng)肽類物質(zhì)先釋放后，在組織中不斷積累達(dá)到一定濃度時才會分泌。Kress等［21］采用體外大鼠皮膚組織逆向神經(jīng)電刺激發(fā)現(xiàn)，PGE2的釋放依賴CGRP含量變化。因此，本研究在電刺激大鼠硬腦膜時，PGE2在血漿與腦組織中釋放可能受到CGRP含量影響。另外，史兆春［22］等采用電刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)對PGE2的釋放進(jìn)行檢測，結(jié)果在大鼠硬腦膜中發(fā)現(xiàn)PGE2的含量顯著增加。

臨床偏頭痛患者主要有腦部血管收縮舒張，痛覺過敏等癥狀。刺激動物的硬腦膜可以出現(xiàn)類似的變化，因此常采用電或化學(xué)刺激腦膜組織建立偏頭痛模型［23］。偏頭痛發(fā)病機制研究表明，除了神經(jīng)肽類，炎癥因子以外，組胺、5－HT以及內(nèi)皮素等也共同參與頭痛的發(fā)生［24］。Akerman 等［25］對組胺在硬腦膜血管擴張作用的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠硬腦膜電刺激時，組胺可引發(fā)腦部中動脈分支血管產(chǎn)生顯著性擴張。另外，5－HT、內(nèi)皮素等也對大鼠硬腦膜血管的擴張起到作用［26－27］。本研究結(jié)果表明，電刺激大鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜時，血漿中除了神經(jīng)肽類以及炎癥因子釋放外，組胺、5－HT和內(nèi)皮素等其他參與頭痛發(fā)生物質(zhì)可能占主導(dǎo)作用。

［1］Wu M，Chen MJ.Progress in the pathogenesis of migraine［J］.Sichuan J Physiol Sci(四川生理科學(xué)雜志)，2007，29(4):173－176.

［2］Ren X，Niu ZP.Research progress in calcitonin gene－related peptide in migrains pathogenesis［J］.Chin J Integ Med Cardio-/Cerebrovasc Dis(中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志)，2004，2(4):229－231.

［3］Williamson DJ， Hargreaves RJ. Neurogenic inflammation in the context of migraine［J］.Microsc Res Tech，2001，53(3):167－178.

［4］Du YF，Wang JZ.Research progress in pathogenesis in migraine［J］.Chin J Clin Neurosci(中國臨床神經(jīng)科學(xué))，2002，10(3):314－317.

［5］Wolff HG，ed.Headache and Other Head Pain［M］，3rd ed.New York:Oxford University Press，1963:551－560.

［6］Jiang L.The pain mechanisms of migraine:gene expression microarray analysis of trigeminal nucleus caudalis after electrical stimulation of dura matter adjacent to SSS in the conscious rats(偏頭痛痛覺機制:電刺激清醒大鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜后三叉神經(jīng)核尾側(cè)復(fù)合體基因表達(dá)譜的實驗研究)［D］.Beijing:Chinese PLA General Hospital＆ Postgraduate Medical School(中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院)，2009.

［7］Williamson DJ，Hargreaves RJ，Hill RG，Shepheard SL.Intravital microscope studies on the effects of neurokinin agonists and calcitonin gene－related peptide on dural vessel diameter in the anaesthetized rat［J］.Cephalalgia，1997，17(4):518－524.

［8］Malick A，Jakubowski M，Elmquist JK，Saper CB，Burstein R.A neurohistochemical blueprint for pain－induced loss of appetite［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(17):9930－9935.

［9］Oshinsky ML，Gomonchareonsiri S.Episodic dural stimulation in awake rats:a model for recurrent headache［J］.Headache，2007，47(7):1026－1036.

［10］Edvinsson L， Goadsby PJ. Neuropeptides in migraine and cluster headache［J］.Cephalalgia，1994，14(5):320－327.

［11］Ebersberger A，Averbeck B，Messlinger K，Reeh PW.Release of substance P，calcitonin gene－related peptide and prostaglandin E2 from rat dura mater encephali following electrical and chemical stimulation in vitro［J］.Neuroscience，1999，89(3):901－907.

［12］Dong Z，Yu SY，Zhao XM，Jiang L，Li FP，Qiu EC，et al.Effect of different electric stimulation parameters on superior sagittal sinus dura blood flow in rats［J］.Chin J Microcirc(微循環(huán)學(xué)雜志)，2008，18(1):13－14，19.

［13］Goadsby PJ，Edvinsson L，Ekman R.Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache［J］.Ann Neurol，1990，28(2):183－187.

［14］Goadsby PJ，Edvinsson L，Ekman R.Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system［J］.Ann Neurol，1988，23(2):193－196.

［15］Zagami AS，Goadsby PJ，Edvinsson L.Extracranial peptide release following stimulation of the superior sagittal sinus in the cat［J］.Cephalalgia，1989，9(10 Suppl):294－295.

［16］Edvinsson L，Rosendal－Helgesen S，Uddman R.Substance P:localization，concentration and release in cerebral arteries，choroid plexus and dura mater［J］.Cell Tissue Res，1983，234(1):1－7.

［17］Liu T，Shen FF，Wei JC，Wan Q.Toungning capsule's impact on the dura artery blood flow and CGRP level in the rats with electrical stimulated trigeminal ganglion［J］.Chin J Pain Med(中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志)，2010，16(4):220－223.

［18］Dong Z，Jiang L，Yu SY.Changes of plasma concentration of calcitonin gene－related peptide and substance P after electrical stimulation on dura mater adjacent to sinus sagittalis superior in rats［J］.Chin J Rehabil Theory Pract(中國康復(fù)理論與實踐)，2011，17(4):334－336.

［19］Vessei L. Neuropeptideandmigraine:The role of CGRP［J］.Cephalalgia，1995，15(suppl 16):3.

［20］Brain SD，Williams TJ.Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene－related peptide［J］.Nature，1988，335(6185):73－75.

［21］Kress M，Guthmann C，Averbeck B，Reeh PW.Calcitonin gene－related peptide and prostaglandin E2 but not substance P release induced by antidromic nerve stimulation from rat skin in vitro［J］.Neuroscience，1999，89(1):303－310.

［22］Shi ZC.Study on the mechanism that extract from chuanxiong and baizhi down regulates COX－2 and PGE2which are the inflammatory mediators on the neurogenic inflammation in the dura mater(川芎白芷萃取物下調(diào)硬腦膜神經(jīng)源性炎性介質(zhì)COX－2及PGE2表達(dá)的研究)［D］.Nanjing:Nanjing Medical University(南京醫(yī)科大學(xué))，2010.

［23］Kassuya CA，F(xiàn)erreira J，Claudino RF，Calixto JB.Intraplantar PGE2causes nociceptive behaviour and mechanical allodynia:the role of prostanoid E receptors and protein kinases［J］.Br J Pharmacol，2007，150(6):727－737.

［24］Guo L， Wang S， Shi XM.Neurogenic inflammation and migraine［J］.Chin J Integ Med Cardio-/Cerebrovasc Dis(中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志)，2006，4(3):243－245.

［25］Akerman S，Williamson DJ，Kaube H，Goadsby PJ.The role of histamine in dural vessel dilation［J］.Brain Res，2002，956(1):96－102.

［26］Br?ndli P， L?ffler BM， Breu V， Osterwalder R，Maire JP，Clozel M.Role of endothelin in mediating neurogenic plasma extravasation in rat dura mater［J］.Pain，1996，64(2):315－322.

［27］Goadsby PJ.The pharmacology of headache［J］.Prog Neurobiol，2000，62(5):509－525.