王穎，王玉琴，楊成德，姚玉玲，陳秀蓉，薛莉

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 甘肅省草業(yè)工程實驗室 中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070）

我國是世界第二大草地資源國家，擁有天然草地近432 hm2，而在各類草地中，高寒草甸類草地面積最大，占全國草地總面積的17.77%；線葉嵩草（Kobresia capillifolia）是高寒草甸類草地的優(yōu)勢牧草之一［1］，其大量的內(nèi)生細菌是挖掘優(yōu)良生物學(xué)功能菌株的微生物資源庫。隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品生產(chǎn)的興起和發(fā)展，作物病蟲害的生物防治越來越受到人們的重視。已從小麥（Triticum aestivum）［2-3］、水稻（Oryza sativa）［4］、馬鈴薯（Solanum tuberosum）［5］、番茄（Lycopersicon esculentum）［6］、柑橘（Citrus reticulata）［7］、煙草（Nicotiana tabacum）［8］、大豆（Glycine max）［9］、棉花（Gossypium）［10］和油茶（Camellia oleifera）［11］等植物中分離得到拮抗內(nèi)生細菌。拮抗內(nèi)生細菌防治范圍廣，對細菌病害、真菌病害和線蟲病害都有一定的作用，因此，內(nèi)生細菌作為一種生防資源，已成為近年來生防菌劑研制開發(fā)的熱點［12-13］。不少學(xué)者對內(nèi)生細菌的生物學(xué)功能進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌不僅可以通過產(chǎn)生植物生長素、赤霉素及細胞激動素等植物促生物質(zhì)［14］來促進植物生長，而且可以通過溶磷作用［15-16］和固氮作用［17-18］轉(zhuǎn)化無效營養(yǎng)為有效營養(yǎng)，刺激和調(diào)控植物生長，增強植物抗病和抗逆能力等。因此，開發(fā)應(yīng)用內(nèi)生細菌資源不僅能解決化學(xué)農(nóng)藥和肥料帶來的諸多問題，還能保持農(nóng)田微生態(tài)系統(tǒng)多樣性，維持農(nóng)田生態(tài)平衡，提高作物產(chǎn)量，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

馬鈴薯壞疽?。≒homa foveata）、炭疽?。–olletotrichum coccodes）和枯萎?。‵usarium avenaceum）是甘肅省馬鈴薯貯藏期最主要的病害，在重病區(qū)引起的爛薯率在30%以上［19-21］。因此，本研究以東祁連山高寒草地線葉嵩草內(nèi)生細菌為對象，以馬鈴薯貯藏期壞疽病菌、炭疽病菌和枯萎病菌為指示菌進行了篩選，對拮抗細菌的分泌IAA、溶磷和固氮等能力進行了評價，并對其進行16S r DNA序列鑒定，以期為線葉嵩草生防內(nèi)生細菌的利用與開發(fā)提供理論依據(jù)，也為馬鈴薯貯藏期病害生物防治提供優(yōu)質(zhì)菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試拮抗細菌 2012年7月分離自東祁連山高寒草地線葉嵩草中的44株內(nèi)生細菌，現(xiàn)保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院微生物多樣性實驗室。

1.1.2 供試病原真菌 馬鈴薯炭疽病菌、馬鈴薯枯萎病菌和馬鈴薯壞疽病菌，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院植物病理實驗室提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)液、PDA培養(yǎng)基和金氏培養(yǎng)基按文獻［22］配制；PKO培養(yǎng)基、蒙金娜培養(yǎng)基［23］和阿須貝無氮培養(yǎng)基［24］分別按文獻的方法配制。

1.2 拮抗能力的測定

1.2.1 拮抗內(nèi)生細菌的篩選 采用平皿對峙法測定抑菌效果。將病原真菌（馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯壞疽病菌）打成直徑為6 mm的菌餅，接在PDA培養(yǎng)基中央，將內(nèi)生細菌點接在距菌餅2.5 cm處，每皿接4點，以只接病原真菌為對照，3個重復(fù)，置于25℃恒溫下培養(yǎng)8 d，測量抑菌帶并計算抑菌率，對拮抗能力強的菌株進行以下試驗。

1.2.2 對病原菌菌絲生長的影響 采用平板對峙法于接種后8 d觀察病原菌菌絲形態(tài)并顯微照相。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征 將拮抗內(nèi)生菌于NA平板劃單菌落，28℃下培養(yǎng)3 d后觀察并描述單菌落培養(yǎng)性狀；在NA平板上培養(yǎng)18～24 h后進行革蘭氏染色、測量菌體大小并顯微照相。

1.3.2 16S r DNA序列鑒定 按上海生工提供的試劑盒（Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒，批號：82561202）提取DNA并檢測，對具有特異性DNA條帶的提取物進行PCR擴增。擴增使用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后在72℃下延伸8 min，終止反應(yīng)。反應(yīng)體系：10×buffer（不含 MgCl2）5μL，MgCl2（25 mmol／L）3μL，d NTP（2.5 mmol／L）1μL，引物27F（10μmol／L）1 μL，引物1492R（10μmol／L）1μL，Taq酶 （2 U／μL）0.5μL，Target DNA（10 ng／μL）1.2μL，dd H2O定容至50μL。經(jīng)檢測具特異性條帶的擴增產(chǎn)物送上海生工測序，所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行同源性對比，采用Clustal 1.8軟件和Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.4 固氮、溶磷、產(chǎn)IAA能力的測定

1.4.1 產(chǎn)IAA能力的定性測定 采用Salkowski比色法［25］。將100μL菌懸液分別接到含100 mg／L色氨酸和不含色氨酸的金氏培養(yǎng)液中，設(shè)置3個重復(fù)，以加等量無菌水的培養(yǎng)液為空白對照，于28℃、120 r／min恒溫振蕩培養(yǎng)12 d，后分別取50μL加入等量比色液（PC比色液或S2比色液），室溫靜置15 min后，觀察顯色反應(yīng)，3個重復(fù)均變紅色表示能分泌IAA，否則不分泌IAA，顏色越深表示分泌數(shù)量越多。

1.4.2 產(chǎn)IAA能力的定量測定 采用純3-IAA 制作標準曲線。配制2組濃度依次為2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5 mg／L和25，50，75，100，125，150，175 mg／L的標準溶液，分別取4 m L，第1組中加等量PC比色液，另1組中加等量S2比色液，設(shè)置3個重復(fù)，黑暗靜置30 min后測定其OD530值并制作標準曲線。將培養(yǎng)12 d的菌懸液和空白對照10000 r／min離心10 min，取上清液4 m L分別加入等量比色液，黑暗靜置30 min后測定OD530值，以只加比色液為空白對照。根據(jù)標準曲線計算菌株分泌IAA的量，并按照PC比色液和S2比色液的測定范圍最終確定結(jié)果［26］。

1.4.3 溶磷能力的定性測定 將263XY1分別點接于PKO和蒙金娜平板培養(yǎng)基上，每皿4個接菌點，重復(fù)3次，28℃恒溫培養(yǎng)7 d后，觀察并測量菌株在培養(yǎng)基平板上形成的溶磷圈大小。根據(jù)溶磷圈直徑／菌落直徑（D／d值）確定內(nèi)生菌的溶磷能力。比值越大，表示溶磷能力越強。

1.4.4 溶磷能力的定量測定 將1 m L 263XY1菌懸液接于PKO和蒙金娜培養(yǎng)液中，裝液量為50／150 m L，以接入等量無菌水的培養(yǎng)液為對照，重復(fù)3次。28℃、160 r／min恒溫振蕩培養(yǎng)10 d后10000 r／min離心15 min，上清液采用鉬銻抗比色法測定有效磷增量［27］。計算公式如下：

式中，P為有效磷增量；K為標準曲線查得顯色液的磷含量（mg／L）；V為顯色時溶液定容的體積（m L）；V1為顯色時吸取上清液的體積（m L）。1.4.5 固氮能力的定性測定 將263XY1點接于阿須貝無氮平板培養(yǎng)基上，每皿4個接菌點，重復(fù)3次，28℃恒溫培養(yǎng)；同時將200μL菌懸液接于阿須貝液體培養(yǎng)基中，重復(fù)3次，以接種等量無菌水為對照，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)，于第3，5，7天觀察其生長狀況，若菌株能夠在平板培養(yǎng)基上明顯生長且能使液體培養(yǎng)基變渾濁則具有固氮能力。

1.5 統(tǒng)計分析

運用Excel 2007和SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行試驗數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗能力測定

2.1.1 拮抗菌株篩選 從44株內(nèi)生細菌中篩選得到7株具拮抗作用的內(nèi)生細菌，編號分別為262XY1、262XY2′、262XY3、263XY1、263XG5、263XG6和 263XG8，其 中 263XG5、263XG6 和263XG8分離自線葉嵩草根部，262XY1、262XY2′、262XY3和263XY1分離自莖部。263XY1與馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯壞疽病菌對峙培養(yǎng)，具明顯的抑菌帶（圖1），抑菌率分別為67.17%，86.24%和70.89%（表1），其抑菌能力顯著高于其他6株拮抗細菌（P＜0.05），因此對該菌株進行了以下試驗。

表1 內(nèi)生細菌的抑菌能力測定Table 1 Inhibition rate of endophytic bacterium on pathogenic fungi

2.1.2 對病原菌菌絲生長的影響 病原菌菌落生長受抑制后，菌落邊緣和抑菌帶接觸部位的菌絲生長緩慢。鏡檢發(fā)現(xiàn)，受抑制菌絲的生長端分支增多，菌絲頂端、中部膨大呈泡狀，有明顯的畸形，部分前端膨脹破裂，內(nèi)含物外溢（圖2），說明263XY1可使病原菌菌絲發(fā)生畸形變化從而影響菌絲正常生長。

圖1 263XY1對3種病原真菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effects of 263XY1 on 3 species of fungus pathogensA：枯萎病菌對照和處理Normal and inhibit of F.avenaceum；B：炭疽病菌對照和處理Normal and inhibit of C.coccodes；C：壞疽病菌對照和處理Normal and inhibit of P.foveata；下同The same below.

圖2 263XY1對病原菌菌絲的影響Fig.2 The influence of 263XY1 against hyphoae of pathogenic fungi

2.2 263XY1菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察 263XY1革蘭氏染色陽性（圖3A），菌體大小為0.36～0.85μm×0.69～1.87μm。在NA平板培養(yǎng)基上菌落大小為3～4 mm，不規(guī)則形，邊緣不整齊，呈波狀，表面褶皺，較干燥，不透明，米白色（圖3B）。

2.2.2 16S r DNA序列鑒定 提取的263XY1基因組經(jīng)16S r DNA引物擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在近1500 bp處有一清晰的PCR特異性條帶 （圖4），經(jīng)上海生工測序得16S r DNA基因序列長度為1451 bp，使用BLAST程序?qū)λ眯蛄性贕enebank中進行同源性比較，263XY1與已報道的Bacillus vallismortis（JQ765433.1），Bacillussubtilis（FJ763648.1），Bacillussubtilis（JF926531.1）和Bacillus amyloliquefaciens（JF899260.1）等多個基因序列的同源性在99%以上，應(yīng)用Clustal 1.8和Mega 4.0軟件進行多重序列比較后鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，表明263XY1與B.vallismortis相似性最高（圖5），因此將其鑒定為Bacillus vallismortis（KF818642）。

圖3 263XY1革蘭氏染色（A）與單菌落（B）Fig.3 Gram staining（A）and a single colony（B）of 263XY1

圖4 263XY1的16S r DNA電泳圖Fig.4 16S r DNA PCR electrophoresis map of 263XY1（1，2：263XY1；3：標記 Marker）

圖5 263XY1的16S r DNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 16S r DNA phylogenetic tree of 263XY1

圖6 263XY1比色反應(yīng)Fig.6 263XY1 colorimetric reaction

2.3 生物學(xué)功能測定

2.3.1 產(chǎn)IAA能力的定性測定 與CK相比，加入不含色氨酸（Trp）的King菌懸液和含色氨酸的King菌懸液均有顯色反應(yīng)，呈淡粉色（圖6），說明263XY1可以分泌IAA。

2.3.2 產(chǎn)IAA能力的定量測定 263XY1經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)12 d后，測定OD530值，結(jié)果表明，不含色氨酸時其分泌IAA的濃度為1.52 mg／L；含100 mg／L色氨酸的金氏培養(yǎng)液中其分泌IAA的濃度為3.31 mg／L，是前者的2倍，說明色氨酸的存在能增加263XY1合成IAA的量，即外源色氨酸可以作為263XY1合成IAA的前體物質(zhì)。

圖7 263XY1在蒙金娜（A）和PKO（B）平板培養(yǎng)基上形成的溶磷圈Fig.7 Halo of phosphate-solubilization microorganism 263XY1 Mongina（A）and PKO（B）solid medium

2.3.3 溶磷能力的定性測定 263XY1在蒙金娜培養(yǎng)基上溶磷圈不明顯（圖7A），D／d值為1.10；但在PKO培養(yǎng)基上溶磷圈明顯（圖7B），D／d值為2.10，說明對無機磷有明顯溶磷能力，而對有機磷的溶解能力較差。

2.3.4 溶磷能力的定量測定 263XY1在PKO和蒙金娜液體培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，有效磷增量分別為38.94和0.11 mg／L，說明263XY1對無機磷有較強的溶磷能力，但對有機磷溶磷能力差。

2.3.5 固氮能力的定性測定 263XY1點接于阿須貝平板培養(yǎng)基后，在第3天時形成菌落；接種于阿須貝液體培養(yǎng)基，7 d后培養(yǎng)液變渾濁，說明262XY1有固氮能力。

3 結(jié)論與討論

近年來，草地退化問題嚴重，在草地的生產(chǎn)中，應(yīng)及時采取措施，才可逆轉(zhuǎn)草地的退化進程，實現(xiàn)草地的可持續(xù)利用?；謴?fù)退化的草地已成為亟待解決的問題，而養(yǎng)分供給能力是成功恢復(fù)退化草地主要依賴的因素之一［28-30］。開發(fā)具有拮抗作用等多功能的牧草內(nèi)生細菌應(yīng)用于草地，一方面可以補充草地自身養(yǎng)分，協(xié)調(diào)草地資源利用中生產(chǎn)功能與生態(tài)功能的沖突；另一方面也可以應(yīng)用于農(nóng)作物病蟲害的生物防治中。本研究以東祁連山高寒草地線葉嵩草中分離的內(nèi)生細菌263XY1為對象，經(jīng)16S r DNA序列鑒定為芽孢桿菌屬的細菌。目前，在國內(nèi)外內(nèi)生細菌多樣性研究的報道中，認為芽孢桿菌作為優(yōu)勢菌種［31-32］，具有開發(fā)成為生物農(nóng)藥和生物肥料的潛力，且效果顯著［33-34］，有進一步開發(fā)利用的價值。

內(nèi)生細菌通過釋放土壤中不溶性的磷元素，促進植物生長和次級代謝物積累已有報道［15，16］。263XY1在PKO含無機磷培養(yǎng)基中的有效磷增量為38.94 mg／L，說明263XY1有較好溶解無機磷的能力，即具有較好促生作用，但是其溶磷機制有待進一步研究。周佳寧等［35］從茅蒼術(shù)（Rhizoma areactylodis）葉片中分離得到45株內(nèi)生細菌研究其促生潛力，其中43株能夠分泌IAA，其濃度在22～268 mg／L，說明內(nèi)生細菌可以分泌IAA促進宿主生長和抗逆；張英等［36］研究4株牧草根際促生細菌互作效應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，其分泌IAA量為0.212～9.33 mg／L，低于單株263XY1分泌的IAA量，263XY1與其他菌株復(fù)配時產(chǎn)生IAA的能力可能更強，但還有待進一步研究。263XY1分離自高寒草地線葉嵩草，其生存的極端環(huán)境可能有利于內(nèi)生細菌在逆境中適應(yīng)力的提高，如拮抗或增加IAA的分泌量等，發(fā)揮更好的促生作用［37］。另外，高寒的生存環(huán)境與馬鈴薯在貯藏期所需要的低溫條件正好吻合，更加適合于開發(fā)為防治馬鈴薯貯藏期病害的生物農(nóng)藥。

目前報道的具生物學(xué)功能的內(nèi)生細菌較多，但同時具備多種功能于一體的內(nèi)生細菌并不多。263XY1為G＋，經(jīng)16S r DNA序列分析將其鑒定為死谷芽孢桿菌，對馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯壞疽病菌均具有較強拮抗作用，抑菌率分別達到67.17%，86.17%和70.89%，且還具有較強溶磷、產(chǎn)生IAA和固氮能力，是一株多功能拮抗內(nèi)生細菌。因此，該菌株有進一步開發(fā)為防治馬鈴薯貯藏期病害的微生物產(chǎn)品的巨大潛力。