張健，廖建軍，吳良銀，錢春艷，何鳳屏

(粵北人民醫(yī)院檢驗科，廣東 韶關(guān) 512025)

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activator of transcriptions，STATs)是一類能與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的胞質(zhì)蛋白,有七個成員：STATL-4、STAT5A、STAT5B 和 STAT6,其中 STAT5廣泛表達(dá)于造血系統(tǒng)。檢測白血病細(xì)胞內(nèi)磷酸化STAT5(P-STAT5)的水平，對進(jìn)一步闡明STAT5異常活化與白血病的關(guān)系具有重要意義[1]。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/winged helixtran scription factor3，F(xiàn)OXP3)是當(dāng)前公認(rèn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)特異性標(biāo)記分子，在腫瘤免疫抑制及逃逸機(jī)制中起重要作用，新近研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3表達(dá)與STAT5的調(diào)控有關(guān)[2]。本研究采用蛋白磷酸化流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測急性白血病(Acute leukemia，AL)患者骨髓中單個核細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的P-STAT5和FOXP3水平，探討兩者在發(fā)病中的作用及其相關(guān)性，為急性白血病的發(fā)病機(jī)制研究及分子免疫治療提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2013年4月至2014年3月廣東粵北人民醫(yī)院血液內(nèi)科45例急性白血病患者(AL),其中急性髓系白血病(AML)29例,急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)16例，患者年齡17～70歲，平均43.2歲，男性21例，女性24例。所有急性白血病患者化療前經(jīng)骨髓穿刺病理檢查結(jié)合FCM免疫表型分析證實，診斷均符合張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》之國內(nèi)診療標(biāo)準(zhǔn)[3]。對照組12名，男6例，女6例，年齡18～67歲，平均42.5歲，均無血液系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 試劑和儀器 FITC標(biāo)記的抗人CD4抗體，APC標(biāo)記的抗人CD25抗體,PE標(biāo)記鼠抗人PY(694)STAT5單抗及其各自同型對照購自美國BD公司。PE標(biāo)記的抗人FOXP3抗體及同型對照購自美國eBioscience公司。Perfix-p試劑盒(含配套的固定、溶血和透膜劑)，美國貝克曼公司。人淋巴細(xì)胞分離液，上海華精高科技有限公司。流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)為美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 方法 肝素抗凝管采集骨髓液2ml，用淋巴細(xì)胞分離液提取骨髓單個核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/ml。各取骨髓單個核細(xì)胞懸液50μl于標(biāo)本試管中，加入50μl固定液(Fix buffer),振蕩搖勻后，室溫孵育10min。加入500μl Lysis solution,充分混勻后，37℃水浴箱孵育15min，待紅細(xì)胞完全裂解。加入1ml冷的洗滌液(PBS,2～6℃),離心(2000r/min,4min)棄上清后加入1ml90%甲醇冰上破膜30min，離心倒掉上清，加入100μl冷的PBS重懸細(xì)胞。胞內(nèi)抗體與膜表面抗體一起孵育,STAT5實驗管加入鼠抗人PE-CY7 STAT5,對照管加入PE-CY7 MS IGG1各20μl。FOXP3實驗管加入鼠抗人FITC標(biāo)記的抗人CD4抗體，APC標(biāo)記的抗人CD25抗體，PE標(biāo)記的抗人FOXP3抗體,對照管加入FITC標(biāo)記小鼠IgG2a、APC標(biāo)記小鼠IgG2a、PE標(biāo)記小鼠IgG2a單抗各 20μl，孵育 30min后洗滌,離心棄上清，加入 Resuspend buffer 500μl,上機(jī)FCM 檢測,每管收集10000個細(xì)胞，記錄陽性細(xì)胞百分率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，對正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以(±s)表示；兩組計量均數(shù)比較用獨立樣本t檢驗，部分計量資料相關(guān)性分析采用單因素線性相關(guān)分析。各數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性白血病各組及對照組P-STAT5、FOXP3的表達(dá)水平 AL患者組骨髓單個核細(xì)胞P-STAT5表達(dá)(2.35±0.82)%較對照組(0.58±0.16)%增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；AL患者組 Foxp3(3.98±1.17)%高于對照組(0.96±0.45)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)%；AML組P-STAT5及FOXP3水平(2.51±0.91)%，(3.72±1.12)%和 ALL組 P-STAT5及FOXP3水平 (2.27±0.78)%，(4.03±1.18)%比較無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組P-STAT5、FOXP3的表達(dá)水平

2.2 急性白血病組P-STAT5與FOXP3相關(guān)性分析 線性相關(guān)性分析結(jié)果表明，AL患者P-STAT5及FOXP3水平顯著正相關(guān)(r=0.81,P<0.05)。

3 討論

急性白血病發(fā)病機(jī)制至今仍未完全明了，目前認(rèn)為，造血細(xì)胞增殖、分化異常及機(jī)體抗腫瘤免疫功能受抑制，在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。STAT家族與JAK家族構(gòu)成重要的JAKSTAT信號傳導(dǎo)途徑，在STAT家族中，STAT5由于在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及癌癥相關(guān)信號途徑中發(fā)揮重要的作用而引起了廣泛的關(guān)注。STAT5與白血病關(guān)系密切，Heuser等[4]的研究表明，STAT5信號傳導(dǎo)途徑在白血病干細(xì)胞的自我更新中起一定作用；Lewis[5]等認(rèn)為STAT5可能是白血病及骨髓增殖性疾病診斷的標(biāo)志分子及治療靶點；能夠抑制STAT5活化的因子可能在預(yù)防和治療癌癥方面有作用[6]。目前與STAT5相關(guān)的主要研究在動物模型、培養(yǎng)細(xì)胞或基因水平較多[1,7]，而STAT5被磷酸化激活后形成磷酸化STAT5(P-STAT5)進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控靶基因表達(dá)的機(jī)理，仍在進(jìn)一步研究當(dāng)中[8]。我們應(yīng)用蛋白磷酸化流式細(xì)胞術(shù)檢測急性白血病患者骨髓中單個核細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的P-STAT5，觀察到AL患者組骨髓單個核細(xì)胞P-STAT5表達(dá)較對照組增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。國外Ikezoe等[9]發(fā)現(xiàn)P-STAT5在 AML患者CD34+CD38-細(xì)胞的表達(dá)高于CD34+CD38+細(xì)胞,國內(nèi)劉炳楠等[10]在骨髓增生異常綜合征(MDS)患者骨髓細(xì)胞內(nèi)同樣發(fā)現(xiàn)與增殖有關(guān)的P-STAT5增高，我們的結(jié)果與他們的發(fā)現(xiàn)相近且可相互補(bǔ)充，完善了在P-STAT5在惡性血液病方面研究的實驗數(shù)據(jù)。

FOXP3又稱叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，是新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)特異性分子標(biāo)記，作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，F(xiàn)OXP3決定了Treg細(xì)胞的免疫抑制功能[11]。近年來大量研究認(rèn)為白血病的發(fā)病與腫瘤的免疫逃逸有關(guān)，在慢性白血病中FOXP3陽性Treg細(xì)胞數(shù)明顯高于正常人[12]，吳小建等[13]發(fā)現(xiàn)骨髓增生異常綜合征進(jìn)展與FOXP3表達(dá)水平密切相關(guān)。我們在急性白血病骨髓細(xì)胞發(fā)現(xiàn)FOXP3表達(dá)水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步證實FOXP3水平的升高，導(dǎo)致機(jī)體抗腫瘤免疫功能降低，可能是急性白血病發(fā)生發(fā)展的重要因素。同時我們還觀察到AML和ALL兩組P-STAT5和FOXP3水平比較無顯著差異，提示AML、ALL發(fā)病在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和免疫逃逸機(jī)制方面可能具有一定的同質(zhì)性。

新近研究發(fā)現(xiàn)，STAT5在Treg的發(fā)育、增殖及轉(zhuǎn)錄因子FOXP3表達(dá)等方面均發(fā)揮重要作用，STAT5蛋白的活化對轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的表達(dá)與調(diào)控起到關(guān)鍵作用,其機(jī)制可能是多種信號分子以Treg的特異性物質(zhì)FOXP3為目標(biāo)，通過STAT蛋白引發(fā)FOXP3表達(dá)，從而促使了在胸腺和外周Treg的存在[2,14,15]。盡管以往的諸多研究對PSTAT5蛋白和FOXP3的表達(dá)及其在白血病致病過程中的作用進(jìn)行了大量探索，并且得到了較一致的觀察結(jié)果，但將兩者結(jié)合在白血病患者骨髓細(xì)胞上同時檢測并進(jìn)行相關(guān)性分析的報道尚未見到。目前，蛋白磷酸化流式細(xì)胞分析技術(shù)的應(yīng)用為揭示病理的信號通路提供了一種可靠的方法[16,17]。隨著磷酸化抗體和特異性單抗的出現(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)信號通路磷酸化蛋白技術(shù)的發(fā)展，可以更好的在蛋白水平對P-STAT5和FOXP3進(jìn)行單細(xì)胞的水平研究，我們的結(jié)果顯示，AL患者P-STAT5及FOXP3水平顯著正相關(guān)(P<0.05)，初步可以推測兩者可能共同參與了該病的發(fā)生過程。

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