錢獻(xiàn)，楊南

(南昌市中心血站，江西 南昌 330025)

Rh血型系統(tǒng)是目前已被確認(rèn)的30個紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最具復(fù)雜性和多態(tài)性的血型系統(tǒng)，其臨床意義僅次于ABO血型系統(tǒng)[1]。Rh血型系統(tǒng)中D抗原的免疫原性強(qiáng)于其他Rh抗原 (E、c、C、e)，大多數(shù)RhD陰性的患者，經(jīng)一次輸注RhD陽性的紅細(xì)胞即可產(chǎn)生RhD抗體，導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)和自身免疫性溶血性貧血[2]。胎兒RhD陽性紅細(xì)胞進(jìn)入RhD陰性母體血液循環(huán)，可導(dǎo)致母體產(chǎn)生抗D抗體，發(fā)生新生兒溶血病。RhD抗原存在多種變異體，其人群經(jīng)基因型分析，可表現(xiàn)多種基因變異，臨床免疫反應(yīng)呈現(xiàn)多樣性。根據(jù)紅細(xì)胞與抗D的凝集反應(yīng)強(qiáng)度、基因變異方式、所在位置，以及對抗原表位的影響，RhD變異體可分為部分D(partial D)、弱 D(weak D)和 DEL(Del)表型。 為此，我們對南昌地區(qū)獻(xiàn)血人群RhD陰性個體進(jìn)行RhD變異體分子背景研究，通過PCR和測序分析2例南昌地區(qū)漢族人弱D表型個體的基因組DNA，觀察到1例DVa(Hus)和2例DVIⅢ，并闡明了DVa(Hus)表型個體RHD基因的斷裂點(diǎn)，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選自本血站2012年5月至2013年5月獻(xiàn)血者24 337人，用EDTA-K2抗凝真空采血試管留取5mL全血標(biāo)本(剔除重復(fù)獻(xiàn)血)，使用單克隆抗D-IgM(加拿大 Biologicals公司)，采用 120孔梯度微量板法獲得的無血緣關(guān)系RhD陰性標(biāo)本85例。

1.2 弱D陽性表型確認(rèn) 對85例初篩陰性標(biāo)本使用3種IgG型抗D試劑采用間接抗人球蛋白試驗(yàn)(IAT)鑒定，2 例樣本(樣本 a、b)經(jīng)鑒定為陽性，據(jù)此確定為弱 D。2例樣本的 RhC、c、E、e表型使用單克隆 IgM抗體 (抗-C:MS24、抗-E:MS12、抗-c:MS33、抗-e:MS16)試劑(德國 Immucor公司)鑒定。

1.3 弱D樣本的RHD基因分析 為了分析2名弱D表型的分子序列，采用序列特異性引物PCR方法(SSP-PCR)同時(shí)分析RHD和RHCE基因，以測定RhCcEe表型和檢測RHD基因外顯子 (Exon)[3]。采用D基因序列分析方法[4]分析RHD基因編碼區(qū)全長序列，測序PCR產(chǎn)物純化后(美國Millipore公司)，直接應(yīng)用BigDyeTMTerminator Cycle標(biāo)準(zhǔn)方法在ABI PrismTM測序儀上進(jìn)行序列測定 (美國Applied Biosystems公司)。

1.4 DVa(Hus)表型個體D/CE基因交換接點(diǎn)分析根據(jù)測序結(jié)果，針對第4內(nèi)顯子(Intron)設(shè)計(jì)了樣本a 的 1 對引物：上游引物(Forward Primer)，5’-AACGATACCCAGTTTGTCTG-3’，D 特異性，位置 Exon 4 606-625；下游引物(Reverse Primer)，5’-ATGACCCTGAGATGGCTGT-3’，D/CE特異性，位置Exon 5 769-751。第 5 Intron 擴(kuò)增引物(D5b-U2，D6-L)[4]，擴(kuò)增樣本a的第4、5 Intron。PCR擴(kuò)增體系25μl：其中 DNA模板 1μl；DNA聚合酶 1U(美國AppliedBiosystems公司)；dNTPs200μM；MgCl21.5mM；6.25pmol/條引物以及 10×PCR 緩沖液。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：30個cycle(Intron4)，40個cycle(Intron 5)。 95℃變性 10min；94℃ 20s，58℃ 30s，72℃2min(Intron 4)，5min(Intron 5)；72℃延伸 5min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物或切膠提取的目的條帶DNA產(chǎn)物(Intron 4)，按照前面的方法進(jìn)行純化測序。

1.5 基因序列結(jié)果用軟件Chromas和DNAMAN(美國Lynnon)聯(lián)合分析。

2 結(jié)果

2.1 SSP-PCR分析結(jié)果 樣本a第5 Exon檢測為陰性，其他 Exon(第3、4、6、7、9、10Exon)均為陽性；樣本b第3～6Exon為陰性，而第 7、9、10 Exon為陽性。RHCE基因序列檢測顯示樣本a為ccEe，樣本b為Ccee，檢測結(jié)果與血清學(xué)檢測結(jié)果一致。

2.2 DVIⅢ型鑒定結(jié)果樣本b的測序PCR結(jié)果均顯示缺失D基因第3～6Exon，序列分析b樣本的第1、2Exon和第7～10Exon，結(jié)果顯示基因序列與正常D基因序列是相同的(GenBank acc.no.AJ299020-1和AJ299026-9)，這就證明樣本b具有融合等位基因RHD-CE(3-6)-D[4]特征?；蚍治雠c血清學(xué)鑒定提示這例樣本為部分DVIⅢ型，存在于單倍體CDe[5]。

2.3 DVa(Hus)型D基因分析結(jié)果 樣本a的測序PCR結(jié)果顯示RHD基因的所有10個Exon均為陽性，序列分析則表明樣本a的RHD基因第1～4Exon和第6～10Exon與正常RHD基因(GenBank acc.no.AJ299020-3和AJ299025-9)一致，因?yàn)榈?Exon的全部序列卻與RHCE基因(RHE，676C)相同，根據(jù)此結(jié)果可判定樣本a為部分D表型DVa(Hus)型，融合基因?yàn)?RHD-CE(5)-D[6]，單倍體為cDE。第4Intron的全部序列與RHD基因的第4Intron完全相同，而第5Intron的序列特異性與RHCE基因相同，同時(shí)存在7個多態(tài)性位點(diǎn)(Gen-Bankacc.no.AY330698)：23-25(GCA)2，98G>A，168-169insG，205-206insT，494-495insA，1256-1257insC，1347G>T。由此可以得出結(jié)論，融合DVa(Hus)等位基因在第5 Exon和第5 Intron發(fā)生RHD/CE基因交換(圖1)。

圖1 DVa基因結(jié)構(gòu)示意圖

2.4 RHD基因數(shù)目分析結(jié)果 2名個體均存在單條D基因，為RHD+/RHD-雜合子。樣本a基因型為cDVaE/cde，樣本b和c基因型為CDVIe/cde。

3 討論

Rh血型是輸血醫(yī)學(xué)重要的血型系統(tǒng)，Rh抗原特別是D抗原具有很強(qiáng)的免疫原性，其高度復(fù)雜的免疫遺傳學(xué)特性而成為輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最重要的研究內(nèi)容。正常紅細(xì)胞膜D抗原血清學(xué)鑒定包括至少9個抗原表位[1]，弱D/部分D表型是由于RHD基因編碼區(qū)單個堿基的突變導(dǎo)致跨膜區(qū)或胞內(nèi)相應(yīng)氨基酸的改變,從而使Rh(D)抗原表達(dá)密度下降，目前主要通過具有抗不同D抗原表位活性的單克隆抗體[2]進(jìn)行血清學(xué)鑒定，在中國漢族人中，有報(bào)道頻率從0.0089%～0.015%不等[6]。部分D表型個體的D抗原位點(diǎn)數(shù)目在不同個體間會存在差異，不排除會有些部分D個體被敏感的IgM+IgG抗-D檢測為D陽性個體的可能。

南昌漢族人群中發(fā)現(xiàn)的DVa(Hus)表型個體的第5(676C)Exon，假如發(fā)生基因順式交換，那么中國人中存在DVacE單倍體。有研究報(bào)道DVa(Kou)、DVa(FK)、DVa(TO)和 DVa-like(YH)表型的 RHD/CE 基因在第5 Exon只是小片段基因交換[6]，DVa(Hus)在高加索人中只進(jìn)行了mRNA的分析[7]，基因組DNA分析證實(shí)DVa(Hus)的RHD基因的第5 Exon和第5 Intron共約1800個核苷酸被RHCE基因替換，其RHD基因的交換接點(diǎn)在第5 Exon的5’端和第5 Intron的 3’端。

中國漢族人群中約有0.2%～0.5%的人常規(guī)血清學(xué)初篩為RhD陰性，這部分RhD陰性的人經(jīng)進(jìn)一步間接抗人球蛋白試驗(yàn)和吸收放散試驗(yàn)查證，約20%～30%為RhD變異體,并非真正的RhD陰性個體。熊莉等[8]對江西地區(qū)154例 RhD陰性表型個體進(jìn)行RHD基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)Exon完全缺失占55.84%，部分缺失占20.78%，檢出Del RhD1227A、弱 D15 型、RHD-CE(2～9)-D、DVa(Has)、DⅥⅢ等多種RHD血清學(xué)陰性RHD等位基因。因此能不能準(zhǔn)確檢出RhD變異體對安全輸血有重要的意義，本血站在RhD陰性的人群中開展RhD變異體表現(xiàn)型和基因型的研究，探討本地區(qū)RhD變異體基因型的分布規(guī)律，以及臨床應(yīng)對措施，建立健全RhD變異體人群的基因型檔案，最大限度地避免輸血不良反應(yīng)的發(fā)生和寶貴的RhD陰性血的資源浪費(fèi)。

[1]陳家學(xué),楊仕坤,石思蓉,等.常規(guī)血清學(xué)RhD陰性個體D基因多態(tài)性的種族差異[J].臨床血液學(xué)雜志,2011,24(12):757-759.

[2]周志方,杜勤,劉海英,等.弱D型輸血致產(chǎn)生抗-D抗體引起輸血不合一例[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2004,27(1):16.

[3]Lan JC,Chen Q,Wu DL,et al.Genetic polymorphism of RhD-negative associated haplotypes in the Chinese[J].JHum Gene,2000,45(4):224-227.

[4]Legler TJ,Maas JH,Kohler M,et al.RHD sequencing:a new tool for decision making on transfusion therapy and provision of Rh prophylaxis[J].Transfus Med,2001,11(5):383-388.

[5]金輝,張一兵,佟青,等.Rh血型弱 D和DEL表型的基因突變分析[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2012,32(4):447-450.

[6]Wagner FF,Gassner C,Muller TH,et al.Three molecular structures cause rhesus D category VIphenotypes with distinct immunohematologic features[J].Blood,1998,91(6),2157-2168.

[7]孫國棟,段現(xiàn)民,伊志柱,等.華北地區(qū)漢族人群RHD抗原弱表現(xiàn)型個體的分子遺傳機(jī)制研究[J].中國輸血雜志,2007,20(2):108-112.

[8]熊莉,孫瑜,李國良,等.154例RHD陰性表型個體的D基因多態(tài)性分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2014,30(4):340-341.