任立凱等

摘要：簡(jiǎn)述了EMS（甲基磺酸乙酯）誘變育種技術(shù)的原理、特點(diǎn)及在小麥誘變育種上的研究進(jìn)展，介紹了小麥EMS誘變育種技術(shù)在連云港地區(qū)的應(yīng)用成果。

關(guān)鍵詞：EMS；化學(xué)誘變；小麥育種；研究；應(yīng)用

中圖分類號(hào)： S512.103.52文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0080-03

收稿日期：2013-11-20

基金項(xiàng)目：江蘇省連云港市科技計(jì)劃農(nóng)業(yè)攻關(guān)（編號(hào)：CN1202、CG1128）。

作者簡(jiǎn)介：任立凱（1981—），男，江蘇徐州人，副研究員，主要從事小麥育種工作。E-mail：renlikai@163.com。小麥EMS（ethyl methane sulfonste，中文名：甲基磺酸乙酯）誘變育種技術(shù)就是用EMS作為化學(xué)誘變劑處理小麥，誘發(fā)其遺傳基因突變，使在短期內(nèi)獲得有利用價(jià)值的突變體，從而為種質(zhì)創(chuàng)新、新品種培育及基因功能的研究等創(chuàng)造條件。小麥EMS誘變育種與常規(guī)育種相比，具有種質(zhì)創(chuàng)新頻率高、遺傳變異譜寬、育種周期短等特性，有效彌補(bǔ)了小麥常規(guī)育種方法短時(shí)間難以獲得新性狀和新基因的不足，為豐富遺傳背景、完整構(gòu)建小麥種子資源庫(kù)提供支持。

1EMS誘變育種機(jī)理及誘變效應(yīng)

EMS是一種改變 DNA 結(jié)構(gòu)的烷化劑。自1953年Kolmark首次研究報(bào)道雙環(huán)氧烷可以有效誘導(dǎo)物種突變[1]，烷化劑就廣泛應(yīng)用于作物的誘變育種，至今已走過60年的歷程。烷化劑帶有的活潑烷基能夠轉(zhuǎn)移到其他電子密度高的DNA分子上去，使堿基許多位置上增加了烷基，正是這種烷化作用改變了氫鍵的能力，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。烷化劑中的功能烷基并不是越多越好，烷基越多帶來的毒性越大，可致供試材料死亡，因此，育種中常用含單功能基的EMS進(jìn)行處理材料。EMS的烷化作用主要發(fā)生在 DNA鳥嘌呤（G）N-7位置上，烷基取代H離子后，使之成為1個(gè)帶正電荷的季銨基團(tuán)，并產(chǎn)生2種效應(yīng)：一是烷化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對(duì)，導(dǎo)致堿基替換，即G—C變?yōu)锳—T，發(fā)生轉(zhuǎn)換型的突變；二是鳥嘌呤的N7烷基活化為季銨基團(tuán)，減弱了N9位上的N-糖苷鍵，致糖苷鍵斷裂造成脫嘌呤。盡管大部分的無嘌呤位點(diǎn)都可以被無嘌呤內(nèi)切酶系統(tǒng)所修復(fù)，但是有時(shí)復(fù)制在修復(fù)之前進(jìn)行，脫去鳥嘌呤的DNA分子會(huì)在進(jìn)一步復(fù)制時(shí)，原來的鳥嘌呤位置成了1個(gè)空位，其互補(bǔ)位置上的堿基就不受嚴(yán)格的配對(duì)限制，4種堿基都有機(jī)會(huì)進(jìn)入，原來的G—C對(duì)可以變?yōu)槿魏螇A基對(duì)如G—C、C—G、A—T、T—A，既有轉(zhuǎn)換又有顛換，這種單一堿基對(duì)改變而形成的點(diǎn)突變是品種改良和退化特性恢復(fù)的價(jià)值所在。此外，EMS還可與核苷結(jié)構(gòu)的磷酸發(fā)生反應(yīng)，形成酯類而將核苷酸從磷酸與糖分子之間切斷，產(chǎn)生染色體的缺失，從而造成置換現(xiàn)象。EMS所誘發(fā)的DNA結(jié)構(gòu)上的變化，都可能促使不表達(dá)的基因或區(qū)段被激活，并讓被掩蓋的性狀表現(xiàn)出來[2-3]。

EMS誘變頻率與其他誘變劑相比，其誘變后產(chǎn)生的顯性突變體相對(duì)較多，易于進(jìn)行突變體篩選。另外，EMS化學(xué)誘變產(chǎn)生高頻率的點(diǎn)突變，致使染色體畸變相對(duì)較少，生理?yè)p傷輕，在用于對(duì)誘變對(duì)象的某一特殊性狀進(jìn)行改良時(shí)，容易得到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的突變體。EMS誘變范圍廣，產(chǎn)生的突變體類型也相對(duì)更豐富[4]。

2小麥EMS誘變育種的研究進(jìn)展

研究人員用EMS處理大麥種子成功獲得突變體[5]后，就開啟了EMS在小麥育種上應(yīng)用的大幕，并經(jīng)多年不懈探索，EMS誘變育種技術(shù)在小麥突變體篩選鑒定、種質(zhì)改良創(chuàng)新等方面取得了很大進(jìn)展。在國(guó)外，Kuraparthy等從構(gòu)建EMS突變體庫(kù)中篩選到控制分蘗的tin3基因，提高了小麥的有效分蘗[6]。Yasui等利用0.5% EMS乙醇溶液（乙醇濃度7%）誘變處理面包小麥cv.Kanto種子，在M2種子中發(fā)現(xiàn)了糯質(zhì)小麥突變體，經(jīng)過多代選擇鑒定，在世界上首次育成了糯質(zhì)普通小麥新品系K107wx1和K107wx2[7]。Bernd等用EMS誘導(dǎo)出1個(gè)小麥Ge2突變體[8]。Colbert等通過EMS創(chuàng)建了2 500 株普通軟質(zhì)小麥突變體庫(kù)，并推算發(fā)現(xiàn)，每12 kb就會(huì)有一突變體產(chǎn)生，其創(chuàng)制的突變體庫(kù)是目前報(bào)道突變頻率最高的[9]。Slade等創(chuàng)建了普通小麥和硬粒小麥的突變體庫(kù)，同時(shí)以小麥顆粒淀粉合成酶Ⅰ（granule bound starch synthase Ⅰ，GBSSⅠ）基因片段為引物，篩選出1 920個(gè)糯性基因小麥突變體，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將EMS化學(xué)誘變技術(shù)與定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，TILLING）相結(jié)合，從中再篩選到了246個(gè)等位基因，獲得了更加豐富的遺傳信息和有價(jià)值的突變個(gè)體，并育成糯性較好的小麥新品種[10-11]。

在國(guó)內(nèi)，EMS誘變育種技術(shù)也取得顯著進(jìn)展。（1）在抗性誘變育種方面，張曉勤等利用EMS誘變獲得了大麥抗葉銹病、早熟等突變體[12]；陳洋等用EMS處理抗黃矮病的小麥-中間偃麥草易位系YW642種子，從M2中篩選出32類不同性狀的突變體73株[13]，為小麥抗黃矮病基因克隆和功能基因組學(xué)的進(jìn)一步研究奠定了堅(jiān)實(shí)的材料基礎(chǔ)；姚秋燕等以EMS為誘變劑進(jìn)行抗條銹Yr近等基因系篩選毒性變異，結(jié)果表明，弱毒性菌株CY17和強(qiáng)毒性菌株CY31為小種毒性突變的出發(fā)菌株，并證實(shí)毒性突變是小麥條銹病菌毒性變異的重要途徑[14]，這為小麥條銹菌致病基因和無毒基因的克隆創(chuàng)建了材料；沈銀柱等以鹽迫為選擇壓力，利用EMS誘發(fā)小麥花藥愈傷組織獲得耐鹽再生植株，獲得的耐鹽變異株離開鹽脅迫3代后經(jīng)鹽池鑒定，后代中有52.9%的品系達(dá)到一級(jí)耐鹽，表現(xiàn)了一定的遺傳穩(wěn)定性，耐鹽品系的結(jié)實(shí)率也逐漸得到恢復(fù)，達(dá)到92.4%[15]；王瑾等用EMS對(duì)溫麥6 號(hào)和周麥17的花藥愈傷組織和幼胚愈傷組織進(jìn)行處理，對(duì)EMS誘變處理后分化的224株再生植株，接種到PEG濃度為80 s/L的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行抗旱篩選，共得到13株抗旱植株，平均變異率為5.8%[16]。（2）在小麥EMS誘變材料的選擇方面，其范圍已從常用種子處理擴(kuò)展到對(duì)花粉、分生組織、愈傷組織等的處理，這樣使EMS誘變擺脫了植物生命周期的限制，提高了突變率。施巾幗等用0.3%～0.4%EMS處理冬小麥品種“農(nóng)大139”授粉7～13 h的休眠合子，發(fā)現(xiàn)其M1損傷明顯，M2代的有益突變頻率達(dá)12.5%[17]；許耀奎等用化學(xué)誘變劑EMS處理春小麥合子，發(fā)現(xiàn)合子總突變率為7.91%，比種子處理高405%，合子期處理的突變率是種子期處理的2倍多[18]；周祉禎等用浸泡法處理春小麥合子，發(fā)現(xiàn)處理受精卵的突變率是處理種子的2.25倍[19]；崔秋華等采用注射法以不同濃度EMS處理春小麥活體植株的幼穗，染色體畸變率和微核率明顯提高，并發(fā)現(xiàn)EMS 在0.1%～0.2%濃度下，染色體畸變率高、出愈率低，高濃度EMS處理降低了出愈率[20]；樸連恩等利用EMS處理小麥合子，進(jìn)行小麥高蛋白突變體的誘發(fā)、篩選和鑒定研究，獲得了比原品種蛋白質(zhì)含量高3%～4%的突變體[21]。（3）在小麥種質(zhì)改良創(chuàng)新、品種選育方面，趙天祥等利用EMS突變技術(shù)創(chuàng)建了小麥品種偃展4110的突變體庫(kù)，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析和鑒定，獲得了幼苗、葉、莖、穗及成熟期等生物學(xué)特性與主要農(nóng)藝性狀的變異體和突變體，特別是發(fā)現(xiàn)了自然突變中少見的變異類型，如株高在10～15 cm左右的特矮變異類型[22]；蔣方山等以EMS處理獲取小麥基部小穗不孕突變體材料，觀察農(nóng)藝性狀與基部不孕小穗的關(guān)系，構(gòu)建了飽和突變體基因庫(kù)[23]；薛芳等在高抗性淀粉誘變育種中以春小麥新春11為材料，篩選出7個(gè)抗性淀粉含量高且綜合性狀優(yōu)良的M2突變家系[24]；中國(guó)科學(xué)院石家莊農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究所利用EMS處理冬小麥品種，M1代變異率達(dá)到15.7%以上，獲得9個(gè)早熟、矮稈突變系，比原品種增產(chǎn)2.8%～205%；徐艷花等通過EMS 誘變獲得722份葉、莖、穗和其他性狀發(fā)生變異的突變體，利用SDSPAGE 對(duì)突變體的高分子量麥谷蛋白亞基進(jìn)行分析篩選，共發(fā)現(xiàn)有21個(gè)缺失不同類型亞基的突變體[25]；施巾幗等利用0.3% EMS與200 Gy γ射線復(fù)合處理原東3號(hào)小麥品種，選育出了抗逆性和適應(yīng)性強(qiáng)、落黃性好、對(duì)條銹與白粉病具有持久抗性、株高85 cm的矮原東3號(hào)；李勁松等利用EMS誘變育成了抗條銹、根腐病能力較強(qiáng)的面包型春小麥新品種甘春20號(hào)[26]。

3小麥EMS誘變育種技術(shù)在連云港的應(yīng)用

連云港市為黃淮海中強(qiáng)筋專用小麥生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)區(qū)。近幾年，通過與南京農(nóng)業(yè)大學(xué)較深入的科研合作，開展了小麥EMS誘變育種技術(shù)應(yīng)用研究，重點(diǎn)在3個(gè)方面取得了一些進(jìn)展。

3.1利用EMS創(chuàng)建了連麥2號(hào)突變體庫(kù)

用0.7%EMS磷酸緩沖液對(duì)自育主栽品種連麥2號(hào)種子進(jìn)行誘變處理，對(duì)獲得的 M2 代植株進(jìn)行農(nóng)藝性狀表型篩選，獲得802份葉、莖、穗和其他性狀如育性、生育期、早衰等發(fā)生變異的突變體，其中，葉片性狀突變151份、莖性狀突變174份、穗部和籽粒性狀突變197份、育性突變64份、生育期突變102份、早衰突變32份、落黃性突變28份、不抽穗突變47份、死亡突變7份，突變頻率分別為1.83%、2.11%、2.39%、078%、1.24%、0.39%、0.34%、0.57%、0.08%。 為黃淮麥區(qū)初步構(gòu)建了適合當(dāng)?shù)胤N植、突變基因豐富的連麥2號(hào) EMS突變體庫(kù)，為本地區(qū)小麥功能基因組研究和新品種選育提供了基礎(chǔ)材料。

3.2EMS對(duì)小麥耐鹽性誘發(fā)突變效果較好

從2007年至今，利用EMS誘變技術(shù)進(jìn)行小麥抗鹽突變體研究，并結(jié)合鹽濃度梯度對(duì)M1、M2進(jìn)行脅迫方法篩選，這種定向篩選方法對(duì)抗逆品種的篩選特別有效。目前，篩選出耐鹽種質(zhì)中間材料12份，這些材料均在不同程度上表現(xiàn)出優(yōu)良的耐鹽特性和較好的遺傳配合力。其中，一些已直接納入系圃進(jìn)行系統(tǒng)選育，并已選到2個(gè)特異性突出的穗行，分別為耐鹽早熟的M582-16和耐鹽抗倒的M26-7-2；還有一些作為耐鹽親本中間材料參與構(gòu)成新的常規(guī)組合，如用耐鹽性強(qiáng)的中間材料M62-503組配了3個(gè)組合0765×M62-503、（0709×濟(jì)22）×M62-503、5152×M62-503，在含鹽045%的鑒定圃上鹽害指數(shù)分別僅為0.21、0.34、0.28，其產(chǎn)量分別比親本對(duì)照高6.9%、8.1%和9.7%，表現(xiàn)出了較好的綜合抗逆特性。

3.3EMS對(duì)小麥粒重誘發(fā)突變效果明顯

在黃淮海麥區(qū)小麥產(chǎn)量構(gòu)成中，粒重是影響產(chǎn)量構(gòu)成要素的短板。隨著施肥水平的提高，小麥育種應(yīng)以增加穗粒重為主攻方向。選用當(dāng)?shù)乇憩F(xiàn)適應(yīng)性強(qiáng)、綜合性狀良好的主栽品種煙農(nóng)19和淮麥20，用0.5% EMS進(jìn)行誘變，并對(duì)誘變后代粒重突變進(jìn)行選擇，取得了明顯的選擇效果。共選中突變系86份，千粒質(zhì)量變幅為32.7～58.1 g，48 g以上8份，比原親平均千粒質(zhì)量45.2 g高2.8 g；穗粒增重0.33～0.73 g的有13份，增加5 g以上的有2份，其中，突變系M20l -7千粒質(zhì)量 54 g，增加6.8 g，且綜合性狀較好；突變體M301-07-4千粒質(zhì)量達(dá)58 g，較原親本增加12.8 g，主穗粒重增加 0.64 g，株高在 105 cm 左右，落黃好，是珍貴的大粒資源。

4展望

小麥EMS誘變育種可以創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，在小麥育種實(shí)踐中發(fā)揮不可替代的作用，但是，應(yīng)清楚認(rèn)識(shí)到化學(xué)突變很多都是不定向的，有些突變會(huì)對(duì)誘變育種不利。有效添加選擇壓來控制誘變方向，實(shí)現(xiàn)定向誘變，進(jìn)一步提高化學(xué)誘變的效率，并對(duì)突變后代各變異類型的發(fā)生頻率及遺傳規(guī)律進(jìn)行高效分析，對(duì)提高突變體的利用效率和選擇的準(zhǔn)確性進(jìn)行深層次的研究，這是EMS誘變育種努力的目標(biāo)。

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