宋慶峰,張紅星,馬亦龍,周鋼橋

1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院介入治療科,南寧 530021;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心,蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室,北京 102206;3.蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心,北京 102206;4.國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心(北京),北京 102206

截止到2012年4月,以單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotide polymorphism,SNP)為遺傳標記,采用全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome wide association studies,GWAS)的策略已在 666種疾病(或性狀)中發(fā)現(xiàn)了3869個顯著關(guān)聯(lián)(P<5.0×10–8)的遺傳易感基因區(qū)域[1]。但是,在這些區(qū)域內(nèi),與復(fù)雜疾病最顯著關(guān)聯(lián)的遺傳變異或致病性遺傳變異都有待進一步確認,其生物學(xué)功能也尚待深入闡明。當(dāng)遺傳易感基因區(qū)域內(nèi)的 SNP位點之間存在較強的連鎖不平衡(Linkage disequilibrium,LD)以及存在遺傳因素和環(huán)境因素交互作用時,上述工作變得更加具有挑戰(zhàn)性。后GWAS時代的主要任務(wù)之一是對復(fù)雜疾病易感區(qū)域內(nèi)的致病性遺傳變異進行精細定位(Fine mapping),即在通過GWAS鑒定到的疾病易感區(qū)域內(nèi)獲取高密度的遺傳變異目錄及其基因型,從中鑒定出易感區(qū)域內(nèi)最顯著關(guān)聯(lián)或致病性的遺傳變異,并闡明其生物學(xué)功能[2]。目前,已出現(xiàn)一些系統(tǒng)性的策略用于復(fù)雜疾病的精細定位研究(表1)。

1 針對常見遺傳變異(Common variant)的精細定位研究

1.1 確定最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點

SNP是可遺傳的變異中最常見的一種變異形式,在群體中其次要等位頻率(Minor allele frequency,MAF)大于1%。目前,GWAS采用的商業(yè)化SNP分型芯片已經(jīng)可以同時檢測100萬個甚至更多的SNP位點。但是,這些芯片仍遠未能覆蓋人類基因組中的全部 SNP位點,一些與復(fù)雜性狀最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點可能會被遺漏。因此,獲得易感基因區(qū)域內(nèi)高密度的SNP目錄是進行精細定位的前提之一?？梢酝ㄟ^以下兩種方法增加易感基因區(qū)域內(nèi)的 SNP密度,然后再進行遺傳關(guān)聯(lián)分析,以確定最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點。

1.1.1 根據(jù)參考數(shù)據(jù)集進行SNP的推斷(Imputation)

由許多國家共同參與的“人類基因組單體型圖計劃”(HapMap計劃)和“千人基因組計劃”(1000 genome project)為人們提供了比較全面的人類基因組DNA序列變異數(shù)據(jù)。以這些研究計劃產(chǎn)生的SNP數(shù)據(jù)為參考集,可以通過計算推斷出與已分型 SNP位點相鄰的未分型SNP位點的基因型,從而大大降低遺漏的可能性[3]。用于推斷的代表性軟件有MACH[4]和IMPUTE[4]等,現(xiàn)已得到廣泛應(yīng)用。例如,Raychaudhuri等[5]以2767個個體的全基因組數(shù)據(jù)為參考集,對6個獨立的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的GWAS數(shù)據(jù)集進行推斷,并對推斷結(jié)果進行了遺傳關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果在 MHC區(qū)域發(fā)現(xiàn)了 5個新的與疾病顯著關(guān)聯(lián)的 SNP 位點(P<1.0 ×10–550)。Peters等[6]在 20488 個非洲裔美國人中,對體重指數(shù)(Body mass index,BMI)的候選易感基因區(qū)域——FTO基因所在的基因組區(qū)域(646 kb)進行推斷和關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果鑒定出一個新的與體重指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點rs56137030(P= 8.3 × 10-6)。Liu 等[7]在來自英國的 2861 例原發(fā)性膽汁性肝硬化患者(Primary biliary cirrhosis,PBC)和 8514例對照中,對約 20萬個多態(tài)性位點進行分型、推斷和關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果新發(fā)現(xiàn)了3個與PBC顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(P<5.0 ×10–8)。以往在日本人群中開展的 GWAS研究發(fā)現(xiàn),MICA基因上的rs2596542與丙型肝炎(Hepatitis C virus,HCV)相關(guān)的肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)顯著關(guān)聯(lián)。Lange等[8]進一步在瑞士人群中對此區(qū)域進行了分型和推斷,關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,MICA基因上游HCP5基因上的rs2244546是一個新的疾病易感性標志物。

SNP的推斷基于單體型結(jié)構(gòu)和單體型內(nèi)各SNP位點之間的LD程度,參考集的樣本量越大,推測的成功率和準確率就越高。但是在現(xiàn)階段,各項研究所能提供的參考集的樣本量均較小。另外,有些SNP位點在人群中等位頻率較低(MAF <2%),且與鄰近的已被芯片檢測到的 SNP位點并不存在較強的LD(r2<0.8),從而無法被成功推斷出來[9]。因此,用推斷這種方法無法徹底解決最顯著關(guān)聯(lián)的SNP被遺漏的情況。

1.1.2 對目標區(qū)域進行重測序(Target region resequencing)

對GWAS鑒定的易感基因區(qū)域進行重測序,將有助于全面了解一個區(qū)域內(nèi)所有的遺傳變異信息,并發(fā)現(xiàn)與復(fù)雜性狀最顯著關(guān)聯(lián)的 SNP位點。此外,還可以發(fā)現(xiàn)一些新的功能性罕見變異(Rare variation)[10]或結(jié)構(gòu)變異,如拷貝數(shù)變異(Copy number variation,CNV)[11]和小的插入-缺失變異(Indel)等[12],從而鑒定到易感基因區(qū)域內(nèi)與復(fù)雜性狀最顯著關(guān)聯(lián)的或致病性的其他各類遺傳變異形式。近年來,高通量的二代測序技術(shù)得以迅速發(fā)展,大大降低了測序的費用及縮短了測序的時間,使得在大量樣本中進行目標區(qū)域的重測序成為現(xiàn)實。例如,Xiang等[13]對已知的高原低氧適應(yīng)基因EGLN1所在的基因組區(qū)域(長約 59.4 kb)進行重測序,新發(fā)現(xiàn)一個非同義突變(rs186996510,D4E)的頻率在高原藏族人群和低海拔漢族人群中存在顯著差異(Fst= 0.709),提示rs186996510可能是高原低氧適應(yīng)的成因性SNP。在對鐮刀狀紅細胞貧血的易感基因重測序研究中,除了發(fā)現(xiàn)新的顯著關(guān)聯(lián)的常見變異位點外,還在MYB基因上發(fā)現(xiàn)了 3個新的與疾病顯著關(guān)聯(lián)(P=5.0×10–3)的罕見遺傳變異[14]。

1.2 通過SNP位點篩選候選易感基因

確定了與復(fù)雜疾病等性狀最顯著關(guān)聯(lián)的遺傳變異后,還要闡明其生物學(xué)功能。通過GWAS鑒定到的最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點大多位于內(nèi)含子、基因間區(qū)等非編碼區(qū)域內(nèi),這對于直接闡明易感SNP位點的生物學(xué)功能造成了一定的困難。研究顯示,這些SNP位點主要通過改變相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達水平或者轉(zhuǎn)錄本的剪接等方式影響疾病的發(fā)生風(fēng)險[15]。

1.2.1 通過調(diào)控元件分析尋找功能性的SNP位點和易感基因

啟動子、沉默子和絕緣子等基因表達調(diào)控元件,能夠通過正調(diào)控[16]或負調(diào)控[17]的機制來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達量。而組蛋白、非編碼RNA等表觀調(diào)控元件,能夠通過末端修飾[18]、自身活性的改變[19]或量的改變[20]等機制來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達量。因此,位于各類調(diào)控元件序列中的與疾病易感性顯著關(guān)聯(lián)的遺傳變異,有可能通過自身等位型的變化影響這些調(diào)控元件的調(diào)控機制而影響相關(guān)基因的表達水平,從而影響疾病發(fā)生的風(fēng)險[21]。例如,Pomerantz等[22]研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌的易感基因區(qū)域8q24中最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點是rs6983267,該SNP位于MYC基因的增強子序列內(nèi),其風(fēng)險等位型能夠增加MYC基因的增強子與轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2的結(jié)合,導(dǎo)致MYC基因的表達量增加,從而增加結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險。Peters等[6]在FTO基因所在基因組區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個新的與體重指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點rs56137030(P= 8.3 × 10-6),并進一步發(fā)現(xiàn)有多個與之呈強LD的 SNP位點處于調(diào)控元件之中,其中 rs1421085在轉(zhuǎn)錄因子CUX1的結(jié)合上具有等位特異性。也有研究發(fā)現(xiàn),某些遺傳變異可以影響基因網(wǎng)絡(luò)內(nèi)不同中樞節(jié)點之間的聯(lián)絡(luò),進而影響下游基因的表達量,最終影響疾病的發(fā)病風(fēng)險[23]。

表1 精細定位的研究策略

1.2.2 通過eQTL分析尋找功能性的SNP位點和易感基因

在人類基因組上,能夠影響基因的mRNA或蛋白表達水平的遺傳變異位點稱為表達數(shù)量性狀位點(Expression quantitative trait locus,eQTL),檢測遺傳變異與mRNA或蛋白質(zhì)表達量之間是否有關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計分析,稱為eQTL分析[24]。對GWAS鑒定到的易感基因區(qū)域內(nèi)的SNP位點進行eQTL分析,有可能發(fā)現(xiàn)直接影響相關(guān)基因表達、進而改變疾病發(fā)生風(fēng)險的功能性SNP位點。按照功能性SNP位點與受其調(diào)控的基因之間的距離,可以分為順式(cis-eQTL,1 Mb范圍內(nèi))和反式(trans-eQTL,1 Mb范圍之外)調(diào)控兩種類型[25]。在以往的研究中,eQTL分析大多是在淋巴細胞系中進行,例如 Morley等[26]在 14個大家系的永生化B細胞中發(fā)現(xiàn),近1000個SNPs能夠作為順式或者反式eQTL位點調(diào)節(jié)3554個基因的表達量。但是,在復(fù)雜疾病的研究中,eQTL分析更應(yīng)該在與疾病對應(yīng)的特定組織中進行[27]。例如,在肝臟組織中,對高脂血癥的易感基因區(qū)域 1p13開展的eQTL分析顯示,最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(rs12740374,P< 1.0 × 10–40)的風(fēng)險等位型能增強SORT1基因啟動子與轉(zhuǎn)錄因子 C/EBP的結(jié)合,從而增加該基因在肝臟中的表達,使肝臟中極低密度脂蛋白(Very low-density lipoprotein,VLDL)的分泌增加,進而增加血清中低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL)和 VLDL的濃度,最終增加高脂血癥的發(fā)生風(fēng)險[28]。

1.3 通過確定顯著關(guān)聯(lián)的單體型和跨種族的單體型對比來確定候選易感基因

單體型是指在后代個體中沒有發(fā)生重組的祖先染色體片段。由于構(gòu)成單體型的SNP位點都位于同一條染色體上的某一區(qū)域內(nèi),且各位點之間具有一定程度的LD,所以有時難以通過獨立性檢驗判定哪個 SNP位點與疾病更具有關(guān)聯(lián)性。在這種情況下,這些SNP位點可能以單體型的形式與疾病相關(guān)聯(lián)[2]。例如,Galameau等[14]在對鐮刀狀紅細胞貧血的研究中,發(fā)現(xiàn)rs7599488和rs10189857(r2= 0.96)與血紅蛋白濃度之間存在顯著關(guān)聯(lián); 進一步的單體型分析發(fā)現(xiàn),與既往研究中所發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)位點rs4671393(P=3.7 × 10–37)相比,rs7599488、rs10189857 和 rs4671393構(gòu)成的單體型具有更加顯著的關(guān)聯(lián)程度((P= 4.0×10–45),從而提示這3個SNP位點通過單體型的形式共同在鐮刀狀紅細胞貧血的易感性上發(fā)揮作用。

在確定了單體型與疾病的相關(guān)性后,如何確定候選易感基因是極其關(guān)鍵的一步。對于一些長度較短、只包含有一個基因的單體型而言,可直接將該基因確定為候選易感基因。對于長度較長、包含有多個基因的單體型而言,可以嘗試在不同種族人群之間比較SNP位點之間LD程度的差異來定位候選易感基因。

HapMap計劃和千人基因組計劃的單體型數(shù)據(jù)顯示,同一基因組區(qū)域內(nèi)的單體型結(jié)構(gòu)在不同種族之間具有差異性。非洲人的單體型比其他種族的單體型更短,原因在于非洲人有更長的歷史,從而有更多的重組來打破原有單體型的結(jié)構(gòu),從而形成新的單體型。同時,大量 GWAS顯示,同種疾病在不同種族之間具有共同的易感區(qū)域[29]。例如,針對發(fā)作性睡病(Narcolepsy)的GWAS顯示,19q13.2區(qū)域是高加索人、亞洲人和非洲裔美國人 3個不同種族共同的易感基因區(qū)域[30]。6q23區(qū)域是高加索人和亞洲人共有的系統(tǒng)性紅斑狼瘡的易感基因區(qū)域,進一步對比兩個種族中該區(qū)域的風(fēng)險單體型結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其中有連續(xù)6個SNP位點的基因型完全一致。因此,推測這6個位點所構(gòu)成的單體型可能為兩種人群共有的風(fēng)險單體型,據(jù)此可將易感基因區(qū)域縮小至 48.5 kb,并確定了TNFAIP3是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的候選易感基因[31]。最近,Wu等[32]通過在不同種族人群中對血脂水平的候選易感基因進行精細定位分析,成功地將GCKR、PPP1R3B、ABO、LCAT和ABCA1等易感基因的致病性位點進一步縮小了范圍,例如發(fā)現(xiàn)GCKR基因中的功能性變異 rs1260326(P446L)可能是甘油三脂水平的成因性 SNP。因此,在不同種族中比較同一易感基因區(qū)域的單體型結(jié)構(gòu),有利于縮小易感區(qū)域的范圍和最終確定候選易感基因。

2 針對罕見遺傳變異(Rare variant)的精細定位研究

GWAS常常是基于“常見疾病-常見變異”的假說而開展的。但是基于“常見疾病-罕見變異”假說開展的研究顯示,基因編碼區(qū)內(nèi)新近發(fā)生的罕見遺傳變異(MAF<1%)中富集了較多的有害變異,因此也能影響復(fù)雜疾病發(fā)生的風(fēng)險[33]。例如,Dickson等[34]對耳聾 GWAS鑒定到的易感區(qū)域進行重測序研究,發(fā)現(xiàn)該易感區(qū)域內(nèi)的罕見變異同樣可影響疾病的患病風(fēng)險。Azzopardi等[35]對結(jié)直腸腺瘤的易感基因APC進行重測序后發(fā)現(xiàn),在未攜帶已知常見風(fēng)險基因型的個體中,基因上多個罕見變異與患病風(fēng)險具有顯著的相關(guān)性(P= 1.7 ×10–2)。

由于罕見變異產(chǎn)生的時間較短,在人群中的頻率很低,想要有效的發(fā)現(xiàn)這些變異需要比發(fā)現(xiàn)常見變異更大的樣本量和更多的經(jīng)費[36],這都極大地限制了對罕見變異的研究。例如,在一項對炎癥性腸病的70個已知易感基因的重測序研究中,在第一階段對 112個病例和 112個對照進行重測序后,未發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生風(fēng)險顯著關(guān)聯(lián)的罕見變異,于是在第二階段擴大樣本量,對896個病例和1216個對照進行重測序,最終在IL23R基因上發(fā)現(xiàn)了p.Arg86Gln、p.Gly149Arg 和 p.Val362Ile與疾病發(fā)生風(fēng)險顯著關(guān)聯(lián)的罕見變異[37]。

最近的研究結(jié)果顯示了罕見變異的一些新規(guī)律,包括下文中提及的罕見單體型攜帶罕見變異、罕見變異在疾病家系中具有較高的頻率和多個罕見變異具有累積效應(yīng)等。針對這些規(guī)律制定的研究策略不但有效地提高了檢測罕見變異的檢驗效能,而且減少了需要研究的樣本量。

2.1 罕見單體型攜帶罕見變異

DNA序列中新的罕見變異可以與常見變異一起構(gòu)成新的單體型,這些單體型由于產(chǎn)生的時間較短,沒有足夠的時間傳播,所以在人群中的頻率小于1%。對與疾病相關(guān)聯(lián)的由常見變異構(gòu)成的罕見單體型進行重測序,有可能在這些罕見單體型上發(fā)現(xiàn)致病的功能性罕見變異[38]。例如,Raychaudhuri等[39]對老年性黃斑變性GWAS鑒定的易感區(qū)域進行深入研究,發(fā)現(xiàn)在對照組中頻率為 0.048%的 H5單體型(CFH基因)能增加疾病的患病風(fēng)險。對該易感區(qū)域內(nèi)攜帶不同結(jié)構(gòu)單體型的 84個個體進行重測序后發(fā)現(xiàn),攜帶H5單體型的6個個體在CFH基因的22號外顯子上均有一個能夠直接改變氨基酸的罕見變異R1210C(在人群中的頻率小于0.1%),而在其他攜帶非H5單體型的個體中均未發(fā)現(xiàn)該變異。通過上述研究策略,Raychaudhuri等成功地從罕見單體型上發(fā)現(xiàn)了一個與疾病易感性顯著關(guān)聯(lián)的罕見變異(P=9.4 × 10–3)。

2.2 罕見變異在疾病家系中具有較高的頻率

在家系中,各成員來源于共同的祖先,其中某一患者攜帶的致病變異可能會傳遞給下一代子女,并導(dǎo)致他們患病。因此,在普通人群中頻率較低的致病性罕見變異,在家系患病個體中會具有較高的頻率,從而更容易被發(fā)現(xiàn)并了解其遺傳模式。例如,Ewing等[40]在對前列腺癌易感區(qū)域17q21-22的研究中,發(fā)現(xiàn)與前列腺癌發(fā)生風(fēng)險相關(guān)的 rs138213197在5083個患者中的等位頻率為1.4%,在1401個對照個體中的頻率為0.1%。但是,在4個前列腺癌的大家系中該變異的頻率為 34%,在攜帶該變異的成員中有 82%的個體患病,大大高于在隨機人群中的比例。上述研究結(jié)果顯示,基于家系的研究策略在精細定位研究中可能更具有優(yōu)勢。

2.3 多個罕見變異具有累積效應(yīng)

因為罕見遺傳變異的發(fā)生具有隨機性,所以易感區(qū)域內(nèi)與疾病發(fā)生風(fēng)險相關(guān)聯(lián)的罕見變異在不同的患病個體中可能發(fā)生在同一易感基因的不同外顯子上,對于這些罕見變異,主要通過負荷檢驗(Burden test)來鑒定其所在的易感基因,同時鑒定它們與疾病發(fā)生風(fēng)險的關(guān)聯(lián)程度[2]。例如,對高脂血癥的易感基因ABCA1、APOA1和LCAT進行重測序,對發(fā)現(xiàn)的多個位于不同外顯子的新的罕見變異進行了負荷檢驗,顯示與疾病發(fā)生風(fēng)險顯著關(guān)聯(lián)(P<1.0×10–4)的罕見變異主要富集在ABCA1基因的不同外顯子上,這些罕見變異能夠直接改變ABCA1基因編碼的蛋白質(zhì),進而降低血清中高密度脂蛋白的濃度,最終增加高脂血癥的發(fā)病風(fēng)險[41]。

3 結(jié) 語

以SNP為遺傳標記,采用GWAS的研究策略成功地發(fā)現(xiàn)了許多復(fù)雜疾病及其他性狀的易感基因區(qū)域。但是,目前也面臨著一些巨大挑戰(zhàn),包括缺乏快速、準確和可重復(fù)使用的方法用于從這些易感基因區(qū)域中精確定位疾病的致病位點或致病基因,以及缺乏簡單、流程化的功能研究方案用于闡明致病位點的生物學(xué)功能,這將是今后研究工作的瓶頸[2]。因此,應(yīng)用新的基因組序列檢測技術(shù)(如高通量測序)和采用更為有效的分析方法,在GWAS鑒定出的易感區(qū)域中精確定位與疾病發(fā)生風(fēng)險最顯著關(guān)聯(lián)的或致病性的遺傳變異,同時采用快速和流程化的功能驗證實驗來闡明其生物學(xué)功能,是后GWAS時代精細定位研究的主要內(nèi)容之一。

目前,針對常見變異的精細定位研究比較多。這類研究主要通過推斷或重測序增加SNP密度,尋找最顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點,并通過功能元件分析、eQTL分析和單體型分析等方法尋找功能性的 SNP位點和易感基因。隨著高通量測序成本的迅速降低,以及基因組功能元件的全面闡釋(例如 ENCODE計劃)[42],預(yù)計今后針對常見變異的精細定位研究將會更多的發(fā)現(xiàn)。另一方面,由于未受遺傳凈化選擇的制約和具有潛在的致病性功能[43],罕見變異在遺傳易感性中的作用在近年來受到越來越多的關(guān)注。今后研究的重要方向之一,將是在通過常見變異鑒定的候選易感基因組區(qū)域內(nèi)尋找致病性的罕見變異和易感基因。進一步對所定位的常見變異或罕見變異進行后續(xù)的功能驗證,將是精細定位研究的關(guān)鍵所在。只有充分理解了這些變異的生物學(xué)意義,才能推動對人類復(fù)雜疾病或性狀的遺傳機制的全面認識。

此外,采用DNA序列的保守性[44]、基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[45]和染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)[46]等策略對易感區(qū)域內(nèi)的遺傳變異進行研究,可以作為上述研究策略的有益補充。另有研究顯示,同義突變雖然不改變編碼的氨基酸,但是有可能通過三聯(lián)體核苷酸影響蛋白質(zhì)的合成速率,從而影響疾病的發(fā)生風(fēng)險[47]。這提示,同義突變也可能是今后精細定位疾病易感基因研究領(lǐng)域的一個全新方向。

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