孫廣鑫,欒雨時,崔娟娟

大連理工大學生命科學與技術學院,大連 116024

MicroRNA(miRNA)普遍存在于生物體內,是由內源基因編碼的長度為22nt左右的單鏈非編碼小分子 RNA[1],可與 RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC) 結合識別其靶mRNA。植物中miRNA序列高度保守并呈現(xiàn)出獨特的表達時序性和組織特異性。在植物細胞核中,內源miRNA基因先形成前體轉錄本pri-miRNA,然后被加工形成較為穩(wěn)定的初級莖環(huán)結構,再進一步形成具有發(fā)夾結構的 pre-miRNA,最后經(jīng) DCL1酶剪切形成 miRNA/miRNA*雙鏈復合體,從細胞核進入細胞質形成成熟的 miRNA[2],與 RISC結合后作用于靶基因,發(fā)揮其翻譯阻遏或者降解作用[3]。miRNA參與植物生長發(fā)育的多種生理生化過程以及各種生物與非生物脅迫反應[4]等。

番茄作為重要的園藝作物,不僅具有很高的經(jīng)濟價值,而且在生命科學研究中也占有舉足輕重的地位。由于番茄具有易雜交、繁殖系數(shù)高、遺傳資源豐富、突變體庫較多、遺傳圖譜廣泛、遺傳轉化體系高效穩(wěn)定等特性,使其成為作物研究中的模式植物之一。在植物與病原物互作的研究方面,由于番茄基因組復雜且病原種類豐富,陸續(xù)得到了眾多的理論信息[5]。2009年,Feng等[6]率先檢測了與病毒相關的番茄 miRNA,其后的研究表明 miRNA在黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)、番茄卷葉新德里病毒(Tomato leaf curl new delhi virus,ToLCNDV)、番茄灰霉病等病害的防御和發(fā)生中均發(fā)揮著重要的調控作用。因此,對miRNA的抗逆功能研究可為番茄種質資源改良提供一定的理論依據(jù)。

目前對 miRNA的挖掘主要有直接克隆(Direct cloning)、正向遺傳學(Forward genetics)篩選和生物信息學(Bioinformatics)分析等方法。直接克隆法比較簡單,第一條植物miRNA就是用該方法發(fā)現(xiàn)的,很多實驗室已經(jīng)利用這種方法從不同生物中發(fā)現(xiàn)了眾多miRNA[7～9],該方法更傾向于發(fā)現(xiàn)中、高量表達的miRNA,但很難發(fā)現(xiàn)一些表達量低、組織特異性強或受誘導表達的miRNA。近年來,高通量測序技術的發(fā)展極大地完善了該方法,并使得大規(guī)模鑒定miRNA成為可能[10,11],很多植物的miRNA都是通過高通量測序獲得的[12～14]。正向遺傳學篩選是在獲得突變個體后,將突變基因分離出來,從而得到一個新的產物。最初的lin-4和let-7就是利用正向遺傳學篩選發(fā)現(xiàn)的[15,16],該方法可以清楚地了解miRNA的功能,但效率很低,只能鑒定到少量的miRNA,因此,正向遺傳學篩選方法無法成為發(fā)現(xiàn)miRNA的主要手段,只是在 miRNA研究早期使用較多。生物信息學分析方法可篩選出經(jīng)各種測序方法獲得的大量數(shù)據(jù)中的miRNA,它能夠彌補直接克隆法的不足,發(fā)現(xiàn)一些豐度低、組織特異性強或受誘導表達的miRNA。隨著一些物種基因組序列、大量EST(Expressed sequence tag)和GSS(Genome survey sequences)等序列的公布,也可以不通過測序,而是根據(jù)miRNA的保守性和獨有的特征,利用生物信息學方法在基因組、EST和 GSS中預測 miRNA前體,進而找到保守的 miRNA,但通過該方法獲得的miRNA還需經(jīng)過實驗驗證以確定其真實性[17,18]。生物信息學分析方法快速、簡單、高效,但是很難發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有miRNA無同源性的新的miRNA。

當番茄受病原物侵染時,體內的多種miRNA及相關靶基因的表達量都會發(fā)生變化,說明miRNA在番茄響應生物脅迫中發(fā)揮著關鍵的調控作用[19,20]。為了篩選出番茄體內與致病密切相關的miRNA,本研究采用生物信息學手段,從Sanger miRNA數(shù)據(jù)庫——miRBase(Release 20:June 2013,http://www.mirbase.org/)和已報道的文獻中找到34個miRNA的成熟序列,預測了它們的靶基因,利用Cytoscope軟件構建這些 miRNA之間的調控網(wǎng)絡,從中篩選出miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和 miR6027,進行了進一步的分析及實時定量 PCR驗證,為深入研究miRNAs的作用機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

野生醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)材料L3708為本實驗室保藏; 致病疫霉菌種P12103為西北農林科技大學單衛(wèi)星教授惠贈。通過NCBI、Web of Knowledge及文獻檢索等途徑,統(tǒng)計出番茄中與致病相關的 miRNA共 34個(表1),其中 miR156、miR159、miR160、miR162、miR166、miR167、miR169、miR171、miR172、miR319、miR395、miR397、miR399、miR482、miR5300、miR6022、miR6023、miR6024、miR6026和 miR6027是在miRBase中已經(jīng)登錄的。利用Primer5軟件分析設計其中 5個 miRNA的上游引物序列及內參基因Actin(GenBank:U60478.1)的上、下游引物序列(表 2)。

1.2 方法

1.2.1 致病相關miRNA序列的獲得及靶基因預測

從 Sanger miRNA數(shù)據(jù)庫——miRBase(http://www.mirbase.org/search.shtml)(release 20)和已報道的文獻及其附件中收集到的34個miRNA全部家族成員的成熟序列。

將上述 miRNA利用軟件 psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget) 進行靶基因預測。在Solanum Lycopersicon(tomato)、transcript、cDNA library version2.3數(shù)據(jù)庫中預測番茄miRNA的靶基因。預測參數(shù)除Maximum expectation設為5.0外,其余均使用程序默認參數(shù)。

1.2.2 致病密切相關miRNA的篩選

利用Cytoscope軟件構建病原誘導的miRNA及其靶基因的調控網(wǎng)絡。根據(jù)各靶基因的個數(shù)確定對應圓點的大小,從中篩選出與致病密切相關的miRNA作為主要的研究和分析對象。

表1 番茄中與致病相關的34個miRNA

表2 設計的5個miRNA的上游引物及Actin的上、下游引物序列

1.2.3 致病密切相關miRNA的靶基因功能分析

根據(jù)上述靶基因預測結果,針對篩選出的若干miRNA的靶基因名稱和 GO注釋號在 Uni-protKB(http://www.uniprot.org/help/uniprotkb)蛋白數(shù)據(jù)庫中分析各靶基因的功能。統(tǒng)計出與病害相關的靶基因。

1.2.4 致病密切相關miRNA的啟動子分析

針對篩選出的若干 miRNA 的基因 5′端上游1 500 bp的啟動子片段,利用 PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線程序進行上游啟動子預測及分析。找出與病害相關的啟動子元件。

1.2.5 致病密切相關miRNA的實時定量PCR驗證

選取長勢相同的番茄五葉期幼苗為試材,以106個孢子/mL的致病疫霉孢子懸浮液噴施葉片,分別于處理后 0 h、3h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h時取樣,用RNAiso plus(TaKaRa,Japan)試劑盒提取總RNA,再用miRNA反轉錄試劑盒One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,Japan)對樣品中的 miRNA進行加尾,加上一個長為60 bp左右的接頭,通過實時定量PCR進行驗證。本研究使用的各miRNA的上游引物見表2,下游引物為試劑盒中提供的通用引物Uni-miR qPCR Primer。反應體系為 25 μL,包括：2 × SYBR?Premix ExTaqTM12.5 μL,cDNA 模板 2 μL,正反向引物各 1 μL,ddH2O 8.5 μL。反應條件：95℃預變性10 s; 95℃變性5 s; 60℃復性20 s,40個循環(huán)。用番茄Actin作為內參基因,熒光數(shù)據(jù)在每個循環(huán)的復性末期采集。對得到的結果用 2-DDCt法分析繪出柱狀圖,并對實時定量PCR產物進行4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 致病密切相關miRNA的靶基因預測及篩選

整理分析psRNATarget在線預測出的miRNA及其靶基因。先構建miRNA與靶基因間的Cytoscope調控網(wǎng)絡。發(fā)現(xiàn)在整個網(wǎng)絡中有多個miRNA攜帶它的靶基因單獨存在,還有一部分miRNA是通過它們的靶基因與少數(shù)幾個miRNA相關聯(lián),而只有一部分miRNA(miR156、miR157、miR159、miR167、miR169、miR171、miR319、miR403、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和 miR6027)是通過它們的靶基因與多個 miRNA相關聯(lián)形成了致密網(wǎng)絡。再以這13個分布較集中的 miRNA為研究對象構建得到它們相互間的Cytoscope調控網(wǎng)絡(圖1)。從圖1可知miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和miR6027的靶基因個數(shù)較多且與其他miRNA的關聯(lián)性較大(至少有4個相關聯(lián)的miRNA)。

2.2 致病密切相關miRNA的靶基因功能分析

圖1 致病密切相關各 miRNA之間的調控網(wǎng)絡(圓的大小與靶基因數(shù)目呈正相關)

用psRNATarget在線軟件預測miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和 miR6027的靶基因,經(jīng)篩選后各獲得多條靶基因。根據(jù)各靶基因的名稱和GO注釋號在Uni-protKB蛋白數(shù)據(jù)庫中查詢每條靶基因的功能,可將它們分為 5類：(1)編碼與脅迫響應相關的蛋白質;(2)編碼與代謝相關的酶蛋白;(3)編碼與跨膜運輸相關的蛋白質;(4)編碼轉錄因子;(5)未知蛋白。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn) miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和 miR6027編碼與脅迫響應相關蛋白質的靶基因分別占各自總靶基因的22.45%、80.30%、71.43%、95.45%、59.09%和 100.00%?？梢?預測到的靶基因大部分與番茄的脅迫響應相關,其中有很多參與致病過程(表3)。

表3 與致病密切相關的各miRNA的靶基因

2.3 致病密切相關miRNA的啟動子分析

應用PlantCARE在線程序對miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和miR6027前體基因5′端上游1 500 bp的序列進行啟動子預測分析。結果表明,除 miR6027外,其他各成員的啟動子區(qū)域不僅存在典型的具有轉錄起始功能的 TATA-box和CAAT-box,還存在多種脅迫相關的順式作用元件(包括激素響應、光響應、生物脅迫響應、厭氧響應、干旱響應和溫度響應元件等)以及與生物脅迫相關的啟動子元件 TC-rich repeats; 同時 miR169、miR482、miR5300和miR6026中還存在與生物脅迫相關的啟動子元件Box-W1。由于不能確定miR6027在染色體上的具體位置,所以未對其進行啟動子分析。

2.4 致病密切相關miRNA的實時定量PCR驗證

5個miRNA的實時定量PCR檢測結果見圖2。致病疫霉處理后,番茄葉片中的miR169、miR482、miR6024、miR6026和 miR6027的表達量均在 3 h內迅速降低,在24 h時普遍有所回升,在48 h時又降到最低點。以上結果說明這5個miRNA都能對致病疫霉處理做出響應。且通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖 3)表明,miR169、miR482、miR6024、miR6026和miR6027的擴增產物都在80 bp左右,說明符合預期長度。

圖2 致病疫霉處理后5個miRNA的表達特性

圖3 實時定量PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測

3 討 論

近年來,miRNA作為基因調控因子備受矚目,已迅速成為生命科學領域的研究熱點。眾所周知miRNA是植物對脅迫響應過程中不可或缺的調控因子,它通過互補作用靶向mRNA抑制或降解相應基因的表達,參與調控生物體內的各項生命活動。本研究采用生物信息學分析方法構建 Cytoscape網(wǎng)絡圖,欲篩選與致病密切相關的 miRNA,對選出的miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和miR6027進行靶基因功能分析和啟動子分析。結果發(fā)現(xiàn),這6個miRNA的靶基因和啟動子基本都與生物脅迫相關,表明它們極可能參與了番茄對脅迫響應的調控過程。為了探究各miRNA在致病疫霉處理下的表達情況,本文又對其中5個miRNA進行了表達特性分析。發(fā)現(xiàn)這5個miRNA的表達量都有顯著變化,且趨勢基本一致,均在48 h時降到最低水平,說明這5個miRNA都能對致病疫霉的接種做出響應,且它們之間可能存在某些相似的通路。由于miR5300的引物特異性不理想,所以本文未對其進行實驗分析。究竟在脅迫下各miRNA與其靶基因存在怎樣的相互關系,后者又是如何表達的,這些問題還有待于進一步的實驗驗證。

番茄作為重要的栽培植物,在受到真菌、細菌、病毒以及線蟲和昆蟲的侵害時常造成大量減產[37],甚至絕收,給農業(yè)生產帶來嚴重影響。研究發(fā)現(xiàn),植物抗病(R)基因能夠識別病原物并引起過敏性反應,它作為防衛(wèi)系統(tǒng)的一員,在沒有病原物侵染時表達量很低,但當病原物侵染后,能夠識別激發(fā)子,誘導抗病基因的過量表達,并激活抗病信號傳導途徑,產生防衛(wèi)反應[38],從而提高作物對病害的抗性。所以,克隆抗性基因將對研究植物和病原物互作、提高植物抗病性具有重要意義。近年來已從不同植物中克隆出了各種R基因。多數(shù)R基因具有NBS-LRR結構域,其中NBS(Nucleotide binding site)是抗病基因核苷酸結合位點。而NBS-LRR編碼基因是抗病基因中的最大家族,大約 3/4的抗病基因都來自于這一家族。根據(jù)N端信號肽的不同,又將NBS-LRR基因分為 TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR兩類[39,40]。這些抗病基因大量存在于植物基因組中,它的作用對象囊括了所有病原物[41]。經(jīng)靶基因功能分析發(fā)現(xiàn)篩選出的6個miRNA的靶基因中均含有NBS-LRR抗性蛋白,推測植物在受到病原物侵染時,這 6個miRNA的表達量也會發(fā)生相應的變化,從而說明了我們篩選的miRNA的確是與致病密切相關的。并且已有實驗證明,當番茄植株受到CMV、TAV、Tolcv和灰霉病菌侵染時,用基因芯片技術檢測到miR169表達量逐漸上調,而其靶基因的表達量下調,說明miR169參與了病原物的脅迫響應。miR482、miR6024、miR6026和 miR6027也被預測到參與植物的免疫應答過程,靶向植物的免疫受體[24]。

由于啟動子控制著基因表達的起始時間和表達程度,而某些miRNA的表達又具有時空特異性和組織特異性。所以,對啟動子的研究將成為miRNA表達特性分析的重要工具[42]。研究發(fā)現(xiàn),大部分miRNA都含有獨立的啟動子,是 RNA聚合酶Ⅱ的產物[43],經(jīng)過轉錄而形成。所以,它的表達很有可能受到精確的調控。為進一步剖析miRNA在脅迫下的表達模式,本研究利用 PlantCARE[44]對番茄miR169、miR482、miR5300、miR6024 和 miR6026基因上游啟動子區(qū)域進行分析,發(fā)現(xiàn)在這些區(qū)域中存在共同的植物病原物侵染和損傷響應順式作用元件TC-rich repeats和Box-W1。表明這些生物脅迫相關miRNA可能參與了相應的逆境脅迫過程,也暗示植物在響應生物脅迫時可能存在某些共同的通路。研究發(fā)現(xiàn)Box-W1存在于如芪合成酶(STS)和病程相關蛋白PR-1、Ypr-10中[45,46],位于多病原體侵染和非生物脅迫響應基因 VvALDH2B8的啟動子區(qū)域,能特異的結合WRKY轉錄因子[47],參與脅迫響應基因的表達調控。所以,這些脅迫響應順式元件的存在為 miRNA參與植物抗逆反應提供了證據(jù)。此外,番茄作為一種模式植物,挖掘和分析其與病害相關的 miRNA還有助于揭示植物與病原物互作的分子機制。

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