于雪,于紅,孔令鋒,李琪

中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,青島 266003

酪氨酸酶是含銅金屬酶,廣泛分布于微生物、動物、植物及人體中,是黑色素生物合成的關(guān)鍵酶,可以催化兩個反應(yīng)：催化L-酪氨酸羥基化轉(zhuǎn)變?yōu)長-多巴和氧化 L-多巴形成多巴醌,多巴醌經(jīng)過一系列反應(yīng)后形成黑色素[1,2]。黑色素合成在生物體中具有重要的生理功能,人類遺傳病如白化病、白癜風(fēng)、耳聾都與黑色素合成中的一個或多個相關(guān)基因的突變有關(guān)[3]。酪氨酸酶在無脊椎動物先天免疫防御中也起著重要的作用[4,5]。酪氨酸酶還參與昆蟲蛻皮后角質(zhì)的硬化以及軟體動物卵囊、足絲、角質(zhì)層的形成等多種生理反應(yīng)[6～10]。

目前,軟體動物中關(guān)于酪氨酸酶的研究主要集中在基因克隆、分離和酶活性分析等方面[8,9,12～15],關(guān)于酪氨酸酶進化方面的分析較少。通過對后生動物酪氨酸酶的進化分析,根據(jù)系統(tǒng)進化樹拓撲結(jié)構(gòu),可將酪氨酸酶分為刺胞動物和原肢類酪氨酸酶、頭索和半索動物酪氨酸酶類似蛋白、脊索動物酪氨酸酶家族和酪氨酸酶相關(guān)蛋白[2]。大部分后生動物中,不同物種的酪氨酸酶和酪氨酸酶類似蛋白存在獨立的基因擴張現(xiàn)象[2]。Felipe等[16]根據(jù)組氨酸排列順序?qū)⒗野彼崦阜譃閍亞型、b亞型、g亞型,并認為a亞型是最原始類型。然后經(jīng)過兩次復(fù)制：第一次復(fù)制,早于單纖毛真核生物的分化,分化出了b亞型即胞內(nèi)型; 第二次復(fù)制,早于動物的分化,分化出g亞型即跨膜結(jié)構(gòu)域型。分化出的多細胞真核生物中有酪氨酸酶亞型缺失現(xiàn)象,即一種或兩種亞型缺失,留下的亞型進行線性擴張[16]。以上均是針對不同物種酪氨酸酶基因家族的系統(tǒng)進化研究,但是對某個物種中線性擴張的酪氨酸酶基因家族的研究還未見報道。例如,合浦珠母貝(PinctadafucataGould)中已發(fā)現(xiàn)并克隆了3個酪氨酸酶基因[8,9],但這些酪氨酸酶的類型以及與其他物種酪氨酸酶的進化關(guān)系等問題仍然有待探索。

太平洋牡蠣(Crassostrea gigasThunberg)亦稱長牡蠣,隸屬軟體動物門雙殼綱(Bivalvia),是世界上養(yǎng)殖范圍最廣、養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的經(jīng)濟貝類。根據(jù)FAO統(tǒng)計,2011年太平洋牡蠣世界總產(chǎn)量達到63.7萬噸(http://www.fao.org/fishery/species/3514/en)。2012 年,太平洋牡蠣基因組測序完成,共發(fā)現(xiàn)26個酪氨酸酶基因,存在基因擴張現(xiàn)象[11]。

本研究對相關(guān)數(shù)據(jù)庫中的太平洋牡蠣和其他一些物種的酪氨酸酶序列進行收集整理、同源比對以及聚類分析,探討了太平洋牡蠣酪氨酸酶基因家族的分類、演化,旨在為太平洋牡蠣酪氨酸酶基因家族的理論研究和實際應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料,為軟體動物酪氨酸酶家族的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 酪氨酸酶氨基酸序列的獲取

太平洋牡蠣酪氨酸酶 tyr19 基因序列已由本實驗室克隆獲得(于雪,未發(fā)表),其余酪氨酸酶基因序列從太平洋牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.oysterdb.cn/)下載獲得。合浦珠母貝酪氨酸酶基因序列從其基因組數(shù)據(jù)庫(http://marinegenomics.oist.jp/genomes/)下載獲得,其他分別隸屬于脊索動物門、軟體動物門、環(huán)節(jié)動物門、扁形動物門、線蟲動物門和腔腸動物門的17個物種的酪氨酸酶從NCBI下載獲得,相關(guān)信息見表1。

表1 序列來源及登錄號

續(xù)表1

1.2 太平洋牡蠣酪氨酸酶基因結(jié)構(gòu)分析

太平洋牡蠣酪氨酸酶所在Scaffold、基因組位置等信息從太平洋牡蠣基因組序列數(shù)據(jù)庫(http://www.oysterdb.cn/)獲得。

1.3 太平洋牡蠣酪氨酸酶基因氨基酸序列分析

使用 SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析并選取酪氨酸酶的保守結(jié)構(gòu)域; 用 SignalP 4.0 和 Cholorop 1.1[17,18]對酪氨酸酶信號肽進行預(yù)測; 用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測酪氨酸酶跨膜結(jié)構(gòu)域; 用 ClustalX 1.83軟件[19]對太平洋牡蠣酪氨酸酶的保守結(jié)構(gòu)域進行多重比對分析。

1.4 太平洋牡蠣酪氨酸酶基因的進化分析

太平洋牡蠣酪氨酸酶的保守結(jié)構(gòu)域的多重比對在 ClustalX1.83[19]中進行,利用 MEGA5.0[20]采用鄰接法(Neighbor-joining method,NJ)并自舉(Bootstrap)1000次計算置信值。不同物種酪氨酸酶的保守結(jié)構(gòu)域序列的多重比對也在 ClustalX1.83 中進行。用MrBayes 3.2[21]構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 太平洋牡蠣酪氨酸酶基因所在Scaffold分析

通過太平洋牡蠣基因組數(shù)據(jù)分析,獲得具有較完整酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域的酪氨酸酶基因21個,分布于14個Scaffold上(圖1)。其中,Scaffold 867上分布的酪氨酸酶基因最多,為4個; Scaffold43702有3個;Scaffold552和Scaffold337各有2個; Scaffold248、Scaffold203、Scaffold483、Scaffold552、Scaffold557、Scaffold612、Scaffold1155、Scaffold1220、Scaffold1719、Scaffold1891和 Scaffold4314均含有一個酪氨酸酶基因。

圖1 太平洋牡蠣酪氨酸酸酶基因家族所在Scaffold分析(數(shù)字代表兩個基因間的距離)

2.2 太平洋牡蠣酪氨酸酶的分類與保守區(qū)域分析

所有物種的酪氨酸酶都具有酪氨酸酶保守結(jié)構(gòu)域,酪氨酸酶保守結(jié)構(gòu)域都包含兩個保守銅離子結(jié)構(gòu)域Cu(A) 和 Cu(B)。太平洋牡蠣酪氨酸酶基因家族中,包括3種類型的酪氨酸酶。tyr5、tyr11、tyr12、tyr17、tyr18為分泌型(Type A); tyr1、tyr2、tyr3、tyr4、tyr9、tyr13、tyr14、tyr15、tyr16、tyr20、tyr21 為胞內(nèi)型(Type B)。tyr6、tyr7、tyr8、tyr10、tyr19 為具跨膜結(jié)構(gòu)域型酪氨酸酶(Type C)。太平洋牡蠣酪氨酸酶保守結(jié)構(gòu)域序列比對分析表明,除 tyr9外其他酪氨酸酶都包含6個保守的組氨酸(圖2)。

2.3 太平洋牡蠣酪氨酸酶的系統(tǒng)進化

太平洋牡蠣酪氨酸酶的系統(tǒng)進化樹分析見圖 3,其酪氨酸酶基因為多拷貝基因,21個酪氨酸酶基因中有9對同源基因存在基因重復(fù)現(xiàn)象(tyr1和tyr21,tyr2和tyr9,tyr3和tyr13,tyr4和tyr5,tyr7和tyr10,tyr11和tyr14,tyr12和tyr17,tyr19和tyr20),其中4對同源基因(tyr12和tyr17,tyr11和tyr14,tyr4和tyr5,tyr19和tyr20)屬于基因內(nèi)復(fù)制,位于相同的Scaffold,其余5對同源基因(tyr1和tyr21,tyr2和tyr9,tyr3和tyr13,tyr7和 tyr10,tyr15和 tyr16)均位于不同的Scaffold,可能屬于基因間的重復(fù)。

圖2 太平洋牡蠣酪氨酸酶Cu(A)和Cu(B)結(jié)合域的比對

太平洋牡蠣分泌型酪氨酸酶的系統(tǒng)進化樹分析見圖 4。太平洋牡蠣所有分泌型酪氨酸酶首先與頭足類分泌型酪氨酸酶聚在一起,然后與隱秀麗線蟲分泌型酪氨酸酶聚在一起。?？退７置谛屠野彼崦竼为毦蹫橐恢?與太平洋牡蠣、頭足類、隱秀麗線蟲分泌型酪氨酸酶分化較大。

太平洋牡蠣胞內(nèi)型酪氨酸酶 tyr1、tyr2、tyr9、tyr15、tyr16與合浦珠母貝胞內(nèi)型酪氨酸酶聚為一支,與鹿角珊瑚、舌囊蟲、大乳頭水螅和?？麅?nèi)型酪氨酸酶分化較大(圖 5A)。太平洋牡蠣胞內(nèi)型酪氨酸酶tyr3、tyr11、tyr13和tyr14與羅阿絲蟲、秀麗新小桿線蟲胞內(nèi)型酪氨酸酶聚為一支,與華枝睪吸蟲、文昌魚、?？痛笕轭^水螅的胞內(nèi)型酪氨酸酶分化較大(圖5B)。

太平洋牡蠣具跨膜結(jié)構(gòu)域型酪氨酸酶 tyr6、tyr7、tyr8、tyr10、tyr19與合浦珠母貝具跨膜結(jié)構(gòu)域型酪氨酸酶聚在一起,與其他具有跨膜結(jié)構(gòu)域型酪氨酸酶種類分化較大(圖6)。

圖3 太平洋牡蠣酪氨酸酶基因家族的系統(tǒng)進化樹

圖4 分泌型酪氨酸酶系統(tǒng)進化樹

3 討 論

Felipe等[17]按照組氨酸排列將酪氨酸酶分成 α亞型、β亞型、γ亞型,并認為α亞型全部含有信號肽,為分泌型。通過研究太平洋牡蠣酪氨酸酶基因家族發(fā)現(xiàn),雖然太平洋牡蠣酪氨酸酶在組氨酸排列上屬于 α亞型,但類型多樣,不僅包括具信號肽的分泌型酪氨酸酶,還包括胞內(nèi)型酪氨酸酶和具跨膜結(jié)構(gòu)域型酪氨酸酶,說明 α亞型酪氨酸酶結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。Sugumaran[22]認為無脊椎動物中的酪氨酸酶缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域。但是通過分析發(fā)現(xiàn)環(huán)節(jié)動物門,扁形動物門和軟體動物門的某些酪氨酸酶均含有跨膜結(jié)構(gòu)域。本研究說明無脊椎動物酪氨酸酶的多樣性及復(fù)雜性。太平洋牡蠣和合浦珠母貝具跨膜結(jié)構(gòu)域型酪氨酸酶保守結(jié)構(gòu)域的所在位置不同于脊索動物門、環(huán)節(jié)動物門和扁形動物門具跨膜結(jié)構(gòu)域型酪氨酸酶。這些物種的跨膜結(jié)構(gòu)域分布在 C末端,而太平洋牡蠣及合浦珠母貝的跨膜結(jié)構(gòu)域分布在N末端與信號肽重疊,而且有些類型只具有跨膜結(jié)構(gòu)域而沒有信號肽。這可能導(dǎo)致了太平洋牡蠣以及合浦珠母貝具跨膜結(jié)構(gòu)域類型與脊索動物門,環(huán)節(jié)動物門和扁形動物門具跨膜結(jié)構(gòu)域型酪氨酸酶的分化較大,使得太平洋牡蠣和合浦珠母貝具跨膜結(jié)構(gòu)域酪氨酸酶在進化中構(gòu)成一獨立分支。

圖5 胞內(nèi)型酪氨酸酶系統(tǒng)進化樹

圖6 具跨膜結(jié)構(gòu)域型酪氨酸酶系統(tǒng)進化樹

通過系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn),太平洋牡蠣酪氨酸酶進化樹上的分布不僅受保守結(jié)構(gòu)域影響還受基因所在位置影響,如tyr4、tyr21并非分泌型酪氨酸酶,但tyr4與tyr5同位于Scaffold 552,tyr21與tyr17同位于Scaffold 337,仍與太平洋牡蠣分泌型酪氨酸酶聚在一起; tyr11并非太平洋牡蠣胞內(nèi)型酪氨酸酸酶,但與 tyr13、tyr14同位于scaffold 867,在進化樹上與太平洋牡蠣胞內(nèi)型酪氨酸酶聚在一起; 太平洋牡蠣 tyr18、tyr20 并非太平洋牡蠣具跨膜結(jié)構(gòu)域型酪氨酸酸酶,但與tyr19同位于scaffold 43702,在進化樹上與太平洋牡蠣具跨膜結(jié)構(gòu)域型酪氨酸酶聚在一起。以上結(jié)果說明酪氨酸酸酶基因所在位置在一定程度上影響了酪氨酸酶保守結(jié)構(gòu)域的分化,也說明了太平洋牡蠣酪氨酸酶基因分化的復(fù)雜性,存在基因內(nèi)和基因間復(fù)制。

基因重復(fù)是基因家族數(shù)量增加的主要方式,太平洋牡蠣酪氨酸酶基因家族中發(fā)現(xiàn)9對基因重復(fù)現(xiàn)象,說明基因重復(fù)是太平洋牡蠣酪氨酸酶基因擴增的一個因素,同時也有力證實了基因重復(fù)是基因組合遺傳多樣化的重要來源[23]。太平洋牡蠣酪氨酸酶的基因重復(fù)伴隨著結(jié)構(gòu)分化,支持了結(jié)構(gòu)分化在基因復(fù)制中的普遍性[24]。根據(jù)太平洋牡蠣酪氨酸酶進化樹分析,發(fā)現(xiàn)Type A酪氨酸中,tyr18與其他Type A酪氨酸酶分化較大,可能是較早分化出來的 Type A酪氨酸酶。Type B酪氨酸酶中,tyr2、tyr9為較早分化出的Type B酪氨酸酶。Type C型酪氨酸中tyr8較早分化出來,而且 Type C型酪氨酸酶與 Type A型、Type B型酪氨酸酶分化較大,沿著較獨立的方向進行基因擴張。其中最早分化的酪氨酸酶 tyr2、tyr8、tyr9、tyr18可能參與比較基礎(chǔ)的代謝,如軟體動物先天性免疫、黑色素形成。隨著基因的再次分化、擴張,預(yù)示著這些基因可能具有特化的新功能,比如參與軟體動物卵囊、足絲、角質(zhì)層的形成等多種特化的生理反應(yīng)[8～10]。太平洋牡蠣酪氨酸酶基因家族的擴張可能與酪氨酸酶在太平洋牡蠣功能的分化密切聯(lián)系。

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