周幸,周楠,余垚,呂紅

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200433

SAGA(Spt-Ada-Gcn5 Acetyltransferase complex)是一個(gè)多亞基的復(fù)合物,在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、釀酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)、果蠅(Drosophila melanogaster)、小鼠(Mus musculus)以及人(Homo sapiens)等真核生物中都保守,主要負(fù)責(zé)體內(nèi)10%的基因轉(zhuǎn)錄[1,2]。在裂殖酵母里,SAGA由19個(gè)亞基組成,可分為4個(gè)功能模塊：乙?；δ苣K(Gcn5、Ada2、Ngg1、Sgf29),負(fù)責(zé)組蛋白的乙?；? 去泛素化功能模塊(Ubp8、Sgf73、Sgf11、Sus1),負(fù)責(zé)組蛋白的去泛素化; SPT模塊(Spt3、Spt7、Spt8、Spt20、Hfi1、Tra1)以及 TAF模塊(Taf5、Taf6、Taf9、Taf10、Taf12),這兩個(gè)模塊的亞基是 TATA BOX的相關(guān)蛋白,負(fù)責(zé)染色質(zhì)重塑和募集其他轉(zhuǎn)錄因子到啟動(dòng)子區(qū)域,參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[3,4]。

SAGA可以通過組蛋白乙?；?、組蛋白去泛素化、染色質(zhì)重塑等方式參與基因的調(diào)控,在細(xì)胞的不同生理階段發(fā)揮功能。已有研究表明,SAGA中spt8+的缺失影響裂殖酵母隔膜降解途徑中關(guān)鍵基因ace2+的轉(zhuǎn)錄,從而造成胞質(zhì)分裂缺陷[5]; Gcn5、Spt8拮抗作用于酵母有性生殖基因ste11+的轉(zhuǎn)錄,調(diào)控酵母的繁殖方式[6]; hGcn5與TRRAP形成二聚體,激活哺乳動(dòng)物細(xì)胞c-Myc的轉(zhuǎn)錄,而Mad抑制其轉(zhuǎn)錄,該平衡若被打破會(huì)導(dǎo)致過度激活 c-Myc,進(jìn)而引發(fā)癌癥[7]; 去泛素化模塊的亞基Sus1具有不依賴轉(zhuǎn)錄的功能,它直接參與了釀酒酵母mRNA的出核調(diào)控[8]。在裂殖酵母里,對(duì)于復(fù)合物亞基的研究,熒光定位分析是闡述各個(gè)蛋白生物學(xué)功能直觀又有效的手段,因此獲得完整的 SAGA各亞基整合熒光定位信息對(duì)進(jìn)一步研究SAGA的功能具有重要意義。此前,Hayashi等[9]構(gòu)建了1 058個(gè)裂殖酵母基因的GFP整合熒光菌株,包括部分SAGA成員,但缺少其中9個(gè)亞基的定位信息; Matsuyama等[10]利用過量表達(dá)熒光質(zhì)粒的方式檢測(cè)裂殖酵母所有蛋白各自的亞細(xì)胞定位信息,但仍缺少SAGA中3個(gè)亞基的定位信息,且過量表達(dá)熒光質(zhì)粒的定位信息可能與內(nèi)源性表達(dá)蛋白的真實(shí)定位存在一定的差異。因此,本研究利用同源重組的方法,在文獻(xiàn)[9]的基礎(chǔ)上補(bǔ)充了 9個(gè)SAGA亞基的整合熒光菌株(Ada2、Sgf29、Sgf73、Sus1、Sgf11、Hfi1、Spt8、Tra1、Taf10),全面分析了內(nèi)源性表達(dá)的19個(gè)SAGA亞基的整合熒光定位。

Sgf73是 SAGA的核心亞基,在不同物種中都同源保守[11]。Sgf73負(fù)責(zé)將去泛素化核心亞基Ubp8連接到SAGA核心模塊(SPT模塊、TAF模塊),且自身與SAGA亞基Ubp8、Sgf11、Sus1形成一個(gè)去泛素化亞復(fù)合物[12]。已有研究表明,缺失sgf73+會(huì)造成多種影響：Ubp8失去了去泛素化功能[12]; Sus1、TREX-II復(fù)合物調(diào)控 mRNA出核的功能受到影響,并且Sus1有出核的異?，F(xiàn)象[12]; PIC復(fù)合物(Preinitiation complex)的組裝不穩(wěn)定使基因的復(fù)制起始受影響[13]。不僅如此,在對(duì)人的研究中,Sgf73的同源蛋白 ATAXIN-7的變異造成了神經(jīng)退行性疾病,并影響視網(wǎng)膜的發(fā)育[14]。這些研究都表明sgf73+的保守性和重要性。缺失sgf73+對(duì) Ubp8、Sus1之外的SAGA亞基是否也有影響還不清楚,因此,本研究在所有 SAGA亞基的整合熒光菌株中分別敲除了sgf73+,通過檢測(cè)熒光定位的方式首次系統(tǒng)分析了sgf73+的缺失對(duì)SAGA各亞基的定位影響。

在分析熒光定位時(shí),本研究發(fā)現(xiàn)sgf73+的缺失還造成了胞質(zhì)分裂的缺陷,表現(xiàn)為隔膜降解受影響。為了進(jìn)一步分析造成這種缺陷的原因,本研究通過功能回補(bǔ)實(shí)驗(yàn),分析了胞質(zhì)分裂過程中與膈膜降解相關(guān)基因ace2+、mid2+在過量表達(dá)的條件下回補(bǔ)△sgf73缺陷的能力,提示Sgf73可能參與了多條影響胞質(zhì)分裂的途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究使用的原始質(zhì)粒 pCHGL-GFP、pFAMLRFP、pREP42-URA4、pLEPF-LEU2,大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α菌株、Top10菌株均為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存,所用到的裂殖酵母菌株見表1。

表1 本研究使用的裂殖酵母菌株列表

1.2 方法

1.2.1 裂殖酵母熒光菌株、缺失突變體菌株的構(gòu)建與驗(yàn)證

裂殖酵母熒光菌株、缺失突變體菌株的構(gòu)建都采用同源重組的方法[15],菌株構(gòu)建均以sgf73+為例。在熒光菌株構(gòu)建過程中(圖1A),分別選取大于300 bp的終止密碼子上游(Up)和下游(Down)片段,設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的上下游引物 U-F/U-R、D-F/D-R(上游HindⅢ/BglⅡ,下游SacⅠ/SpeⅠ)。當(dāng)上下游片段都連接到質(zhì)粒載體上后,通過HindⅢ/SpeⅠ雙酶切獲得線性質(zhì)粒片段,利用酵母轉(zhuǎn)化使片段與宿主菌的基因組產(chǎn)生同源重組。挑取轉(zhuǎn)化后的單克隆菌落,抽取基因組 DNA(gDNA)利用驗(yàn)證引物JD-U-F/ JD-U-R、JD-D-F/JD-D-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證,若兩對(duì)驗(yàn)證引物能擴(kuò)增出條帶,則菌株構(gòu)建成功。在缺失突變菌株的構(gòu)建過程中(圖1B),首先分別選取大于300 bp的ORF(Open reading frame)上下游片段,建步驟與熒光菌株一致,僅在驗(yàn)證時(shí)多用一對(duì) ORF內(nèi)部引物ORF-F/ORF-R進(jìn)行擴(kuò)增,若該引物對(duì)不能擴(kuò)增出條帶,而JD-U-F/JD-U-R、JD-D-F/JD-D-R引物對(duì)能擴(kuò)增出條帶,則菌株構(gòu)建成功。菌株構(gòu)建引物序列見表2。

1.2.2 酵母轉(zhuǎn)化

制備感受態(tài)：收集處于對(duì)數(shù)期(OD600值為 1～2)的酵母菌體,總OD600值大于 10,用 10 mL LiAC/TE/PEG4000/ddH2O 混合液(1:1:2:6)重懸,離心后再用550 μL混合液重懸,100 μL每管分裝待用。LiAC濃度為1 mol/L,pH值為7.5; TE是0.1 mol/L Tris堿與 0.01 mol/L EDTA混合液; PEG4000的濃度為50%。

酵母轉(zhuǎn)化：加入 10 μL待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；蚓€性DNA片段,3 μL煮沸的單鏈DNA于感受態(tài)細(xì)胞中,充分打勻后加入 260 μL LiAC/TE/PEG4000(1:1:8),漩渦震蕩混勻后30℃水浴45 min,42℃熱激15 min,低速(小于 5 000 r/min)離心收集并棄去上清液,加入1 mL 培養(yǎng)液于30℃培養(yǎng)4～6 h,涂布于固體選擇培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)3～4 d。

1.2.3 裂殖酵母基因組DNA提取

收集菌體,加入300 μL苯酚、氯仿、異戊醇混合液(25:24:1),300 μL DNA裂解液,300 μL玻璃珠,渦旋震蕩1 min,再加入300 μL 1×TE,上下顛倒數(shù)次再渦旋震蕩1 min。13 000 r/min離心10 min,將上清轉(zhuǎn)入等體積的氯仿、異戊醇混合液(24:1)中,上下顛倒數(shù)次,13 000 r/min離心10 min,將上清轉(zhuǎn)入2倍體積的無水乙醇中,-20℃放置 30 min。13 000 r/min離心5 min,棄去無水乙醇,用800 μL 75%的乙醇洗一次,13 000 r/min離心5 min后棄乙醇并烘干,加入 1×TE溶解基因組 DNA,渦旋震蕩1 min后待用。

圖1 裂殖酵母熒光菌株、缺失突變體菌株的構(gòu)建與驗(yàn)證(本研究質(zhì)粒構(gòu)建示意圖均以sgf73+為例)

表2 構(gòu)建sgf73+熒光菌株和缺失突變體菌株所需引物

1.2.4 顯微檢測(cè)

收集處于對(duì)數(shù)期(OD600=1左右)的菌體,用ddH2O重懸并離心,用1×的Hoechst(Sigma)重懸染核,避光靜置15 min以上,離心收集菌體,取2 μL鏡檢。熒光顯微鏡(型號(hào)為奧林巴斯X51)藍(lán)色通道激發(fā)綠色整合熒光(曝光時(shí)間為 300～500 ms); 黃色通道激發(fā)紅色整合熒光(曝光時(shí)間為 100～200 ms); 多功能通道激發(fā) Hoechst染核熒光(曝光時(shí)間為 30～50 ms),DIC(微分干涉)為白光(曝光時(shí)間為30 ms)。檢測(cè)時(shí),若檢測(cè)到特異性熒光,則背景噪音會(huì)很少;若特異性熒光很少或者沒有特異性熒光,則會(huì)有大量背景噪音。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂殖酵母SAGA全亞基整合熒光定位分析

本研究對(duì)裂殖酵母SAGA的乙?；δ苣K、去泛素化功能模塊、SPT模塊及TAF模塊中各亞基的內(nèi)源表達(dá)熒光定位進(jìn)行系統(tǒng)分析。

熒光分析乙?；δ苣K(Gcn5、Ada2、Ngg1、Sgf29)各亞基的定位發(fā)現(xiàn),Ada2、Ngg1、Sgf29完全定位于核內(nèi)(圖2A),提示它們僅在核內(nèi)發(fā)揮功能。Gcn5是SAGA中重要的酶學(xué)功能亞基之一,具有組蛋白乙?；揎椆δ堋＝Y(jié)果表明,它在核內(nèi)和胞漿中都有定位(圖2A),胞漿的定位提示Gcn5可能在胞漿中也有乙?；饔?。

圖2 乙酰化模塊和去泛素化模塊中各亞基熒光定位

本研究也分析了去泛素化功能模塊(Sus1、Sgf11、Sgf73以及 Ubp8)各亞基的熒光定位。在裂殖酵母里,Sus1和Sgf11的熒光定位信息首次被檢測(cè)到。其中Sus1不僅定位于核內(nèi),在核膜上也能檢測(cè)到明顯的點(diǎn)狀定位(圖2B)。裂殖酵母Sus1的定位與釀酒酵母一致[8],提示在裂殖酵母里 Sus1可能也參與了mRNA的運(yùn)輸。Sgf11、Sgf73、Ubp8的定位方式一致,大部分定位于核內(nèi),同時(shí)在胞漿中也有少量熒光定位(圖2B)。去泛素化也是SAGA的重要酶學(xué)功能,其中 3個(gè)亞基有少量胞漿的熒光定位提示SAGA可能在胞漿中也有去泛素化作用。

SPT模塊是一類與TATA BOX相關(guān)的蛋白,裂殖酵母里由 Spt3、Spt7、Spt8、Spt20、Hfi1以及 Tra1組成。結(jié)果表明,Spt3、Spt8、Tra1主要定位于胞漿內(nèi),核內(nèi)分布較少(圖 3A),提示 Spt3、Spt8、Tra1可能主要在胞漿中發(fā)揮功能。Tra1是SAGA最大的亞基,蛋白大小為422.3 kDa,本研究是首次檢測(cè)到其熒光定位信息。在檢測(cè)Spt3-GFP菌株的染核熒光時(shí),發(fā)現(xiàn)它呈多核表型(單個(gè)細(xì)胞內(nèi)超過2個(gè)細(xì)胞核,圖 3A),而其他亞基的基因在融合 GFP后表型正常(圖2,圖3)。我們推測(cè)這可能是由于GFP序列的插入影響了Spt3的某些功能,使細(xì)胞分裂出現(xiàn)缺陷而不能及時(shí)分開,但復(fù)制過程正常進(jìn)行。Spt7、Spt20大部分定位于核內(nèi),胞漿中有少量定位(圖 3A),提示它在胞漿中也可能發(fā)揮作用。Hfi1在核內(nèi)與胞漿中較均勻地分布(圖 3A),提示它可能在核內(nèi)和胞漿中能發(fā)揮同等功能。

TAF 模塊由 Taf5、Taf6、Taf9、Taf10、Taf12組成,且這5個(gè)亞基同時(shí)也存在于TFIID復(fù)合物[16]。本研究發(fā)現(xiàn),Taf5和 Taf6大部分定位于核內(nèi),少量定位于胞漿中(圖 3B),提示它們?cè)诎麧{中也可能發(fā)揮作用。Taf9和Taf10僅定位于核內(nèi),說明它們僅在核內(nèi)發(fā)揮作用(圖2D)。Taf12類似于Hfi1,在核內(nèi)與胞漿中較均勻地分布,提示它也可能在核內(nèi)和胞漿中均等地發(fā)揮功能(圖3B)。

圖3 SPT模塊,TAF模塊中各亞基熒光定位

本研究將獲得的整合熒光定位結(jié)果與Matsuyama等[10]利用過量表達(dá)熒光質(zhì)粒的方法所獲得的熒光定位進(jìn)行了對(duì)比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有Ada2、Spt20、Taf5、Taf6的定位情況與本研究的結(jié)果一致,其余均有差異(表3)。這種差異可能是過表達(dá)質(zhì)粒無法準(zhǔn)確控制蛋白的表達(dá)量,或因?yàn)槭钱愇槐磉_(dá),導(dǎo)致某些蛋白的定位不準(zhǔn)確。

另外,釀酒酵母 SAGA各亞基整合熒光的定位與本研究獲得的裂殖酵母的整合熒光液有明顯差異[17]。釀酒酵母除Sus1與裂殖酵母一致外,其余所有亞基都完全定位于核內(nèi)(表3)。盡管釀酒酵母與裂殖酵母同屬子囊菌綱,但兩者存在 3～4億年的進(jìn)化差異,裂殖酵母更接近于哺乳動(dòng)物細(xì)胞[18],裂殖酵母SAGA出現(xiàn)多種定位情況提示它可能具有特異于釀酒酵母的功能。正如Spt8影響了裂殖酵母的膈膜降解,而釀酒酵母中還沒有隔膜的形成。

2.2 缺失sgf73+對(duì)SAGA各亞基熒光定位的影響

為了分析sgf73+的缺失對(duì)SAGA各亞基的熒光定位的影響,本研究在 SAGA各個(gè)亞基的整合熒光菌株中分別敲除了sgf73+。如圖4A所示,sgf73+的缺失直接影響并減少了乙酰化功能模塊中 Gcn5、Ngg1、Sgf29在核內(nèi)的熒光定位,提示Sgf73可能參與維持了 SAGA乙?；δ軄喕姆€(wěn)定性。另外,Gcn5和Sgf29核內(nèi)熒光減弱甚至消失的現(xiàn)象與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中觀察到的現(xiàn)象相吻合[14],這進(jìn)一步支持了我們的結(jié)論。但是sgf73+的缺失并沒有影響Ada2的核內(nèi)定位,這說明Sgf73對(duì)4個(gè)乙?；瘉喕淖饔貌灰恢?。

已有研究表明,去泛素化功能模塊缺失sgf73+后,Sus1、Sgf11、Ubp8脫離 SAGA 核心[12],并且Ubp8失去了去泛素化的功能,這與本研究的結(jié)果相符。熒光數(shù)據(jù)表明,Sgf11、Ubp8的核內(nèi)熒光定位幾乎完全消失,Sus1的核內(nèi)定位也有明減少,盡管Sus1在核孔處定位正常(圖 4B)。因此,在裂殖酵母里缺失 Sgf73后不僅影響了 Ubp8、Sgf11、Sus1與SAGA的結(jié)合,同時(shí)還影響了它們?cè)诤藘?nèi)的定位,這說明SAGA去泛素化模塊的穩(wěn)定性依賴于Sgf73。Sus1在核孔處定位正常是否影響了TREX-II復(fù)合物的功能還需要進(jìn)一步研究。

表3 分析比較裂殖酵母與釀酒酵母SAGA所有亞基的熒光定位

SPT模塊中Hfi1、Spt7、Spt20是SAGA的核心結(jié)構(gòu)亞基[19],它們受到影響則會(huì)極大程度影響SAGA的穩(wěn)定性。缺失sgf73+后,Spt3、Spt8、Spt20、Hfi1、Tra1的定位沒有變化,然而Spt7的核內(nèi)熒光幾乎完全消失(圖5A)。這說明SPT模塊中只有Spt7的穩(wěn)定性依賴于 Sgf73,而其他亞基的正常定位并不需要它來維持。由于缺失sgf73+影響了Spt7,提示sgf73+的缺失可能通過影響 Spt7的穩(wěn)定性從而間接造成了SAGA整體的不穩(wěn)定。

TAF模塊的5個(gè)亞基是SAGA中僅有的必需基因,這5個(gè)亞基缺失sgf73+后的熒光定位(圖5B)與缺失前(圖 3B)完全一致,說明缺失sgf73+并不會(huì)影響到TAF家族蛋白的定位,對(duì)它們的穩(wěn)定性沒有影響。

綜上所述,在缺失sgf73+后有 7個(gè) SAGA亞基的熒光定位受到影響,分別是Gcn5、Sgf29、Ngg1、Ubp8、Sgf11、Sus1、Spt7,其余的亞基在缺失前后并沒有明顯的定位變化(表 4)。這說明盡管這 19個(gè)亞基屬于同一個(gè)復(fù)合物,但各亞基與 Sgf73的聯(lián)系并不一致。

2.3 sgf73+缺失對(duì)裂殖酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

在分析缺失sgf73+對(duì)各亞基熒光定位的影響時(shí),本研究發(fā)現(xiàn)SAGA所有亞基熒光菌株都呈多核表型(細(xì)胞核數(shù)大于2,圖4～5),同時(shí),DIC數(shù)據(jù)也顯示在缺失sgf73+后出現(xiàn)了異常表型。在圖6中,缺失sgf73+前為Control組,缺失sgf73+后為Dsgf73組。Control組除文章前面提到Spt3-GFP有異?，F(xiàn)象以外,其余都與WT(野生型)表型一致(圖6,A～E)。Dsgf73組都呈現(xiàn)多膈膜表型(隔膜數(shù)≥2)。盡管本研究發(fā)現(xiàn)缺失sgf73+影響了Gcn5和Ubp8的熒光定位(圖4,A～B),但gcn5+和ubp8+各自的缺失突變體并沒有表現(xiàn)出胞質(zhì)分裂缺陷,表型與WT一致(結(jié)果未發(fā)表)。這說明造成sgf73的分裂缺陷與 SAGA酶學(xué)活性亞基Gcn5和Ubp8都無關(guān)。

2.4 隔膜降解相關(guān)基因ace2+、mid2+過表達(dá)回補(bǔ)分析

圖4 sgf73+的缺失對(duì)乙?；K和去泛素化模塊各亞基熒光定位的影響

為了進(jìn)一步研究缺失sgf73+引起的多隔膜現(xiàn)象,本研究在sgf73菌株中分別轉(zhuǎn)入過表達(dá)質(zhì)粒pRep42-ace2+、pRep42-mid2+、pRep42-sgf73+,檢測(cè)在過量表達(dá)ace2+、mid2+、sgf73+的情況下能否回補(bǔ)sgf73的胞質(zhì)分裂缺陷。

去除培養(yǎng)基中的Thaimine后,sgf73+幾乎完全回補(bǔ)自身的缺陷,ace2+則完全不能回補(bǔ),而mid2+能夠部分回補(bǔ)該表型(圖7)。Helmlinger等[20]的芯片數(shù)據(jù)顯示,△sgf73與△spt8都造成ace2+和mid2+的mRNA 水平下調(diào),而過表達(dá)ace2+、mid2+出現(xiàn)回補(bǔ)差異。因此,在△sgf73中可能是Ace2調(diào)控Mid2出現(xiàn)異常,導(dǎo)致過量表達(dá)ace2+也無法使mid2+處于正常水平。由于ace2+能夠完全回補(bǔ)△spt8的缺陷而無法回補(bǔ)△sgf73的缺陷,表明缺失sgf73+和spt8+所造成的胞質(zhì)分裂缺陷不一致。另外,mid2+也只能部分回補(bǔ)△sgf73的多膈膜表型,說明sgf73+的缺失不僅通過影響mid2+從而造成胞質(zhì)分裂缺陷,可能還通過其他途徑影響了胞質(zhì)分裂。

3 討 論

本研究以 Hayashi等[9]和 Matsuyama等[10]的工作為基礎(chǔ),完整地獲得了裂殖酵母 SAGA所有亞基的整合熒光定位,其中首次成功地在裂殖酵母里檢測(cè)到了Sus1、Sgf11以及 Tra1的熒光定位,分析總結(jié)了SAGA各亞基的熒光定位類型,并歸類為4類：第一類,熒光完全定位于核內(nèi),提示這些亞基僅在核內(nèi)發(fā)揮作用,包括 Ada2、Ngg1、Sgf29、Taf9、Taf10;第二類,熒光大部分定位于核內(nèi),僅少量定位于胞漿中,包括 Gcn5、Sgf11,Sgf73、Ubp8、Spt7、Spt20、Taf5、Taf6,提示這些亞基可能在胞漿中也發(fā)揮功能,但至今尚未有相關(guān)報(bào)道; 第三類,核內(nèi)與胞漿中都有分布,且比較均勻,如 Hfi1、Taf12,它們可能在核內(nèi)與胞漿中有等同的作用,但也無相關(guān)報(bào)道; 第四類,這些亞基有較特殊的定位,如 Sus1、Tra1、Spt3、Spt8(表3)。這些亞基不同的定位方式體現(xiàn)了SAGA的復(fù)雜性與多功能性,但 SAGA的功能還未完全揭開,僅少數(shù)亞基有單獨(dú)的研究,新功能還有待發(fā)現(xiàn)。本研究的整合熒光定位信息對(duì)今后的功能研究起到一定的提示和參考作用。

圖5 sgf73+的缺失對(duì)SPT模塊、TAF模塊各亞基熒光定位的影響

表4 SAGA各亞基缺失sgf73+前后熒光對(duì)比

裂殖酵母整合熒光與過表達(dá)熒光出現(xiàn)的差異可能是文獻(xiàn)[10]所述的方法精確度不高,難以保證加入Thaimine的量和處理的時(shí)間恰好使Pnmt1啟動(dòng)子與整合熒光的內(nèi)源啟動(dòng)子處于同一啟動(dòng)水平。這種方法是將基因的ORF以及YFP(Yellow fluorescence protein)構(gòu)建在含有Pnmt1啟動(dòng)子的過表達(dá)質(zhì)粒上,通過與裂殖酵母2號(hào)染色體上的基因Leu1同源獲得熒光菌株,并通過加入Thaimine來控制熒光質(zhì)粒的表達(dá)量; 另外,由于所有需要表達(dá)熒光的基因都是與裂殖酵母2號(hào)染色體上基因Leu1同源,而并非該基因原位,因此,在定位上與整合熒光可能會(huì)有部分差異(表3)。裂殖酵母與釀酒酵母定位的差異說明SAGA盡管保守,但由于裂殖酵母在進(jìn)化程度上高于釀酒酵母,且已經(jīng)出現(xiàn)有絲分裂,那些在胞漿中有定位的亞基可能以某種方式參與到了有絲分裂過程或其他釀酒酵母不具備的生理過程中。

本研究還利用敲除技術(shù)系統(tǒng)分析了缺失sgf73+對(duì)其他SAGA亞基的蛋白定位影響。如表4所示：Gcn5、Sgf29、Ngg1、Ubp8、Sgf11、Sus1、Spt7這 7個(gè)亞基在缺失sgf73+后核內(nèi)熒光定位明顯減少甚至消失,而其余亞基的熒光定位在缺失前后并沒有明顯變化。這說明在整個(gè) SAGA里,部分亞基的穩(wěn)定性或功能依賴于 Sgf73,而其余亞基的穩(wěn)定性或功能并不需要Sgf73來維持。

本研究還發(fā)現(xiàn)△sgf73菌株呈現(xiàn)多隔膜表型(圖6),并同時(shí)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞核(圖4,圖5)。這說明缺失sgf73+影響了細(xì)胞的胞質(zhì)分裂,但對(duì)DNA復(fù)制沒有造成影響,且這種影響不依賴于酶學(xué)活性亞基Gcn5和Ubp8。裂殖酵母的膈膜分為兩層,外層由Agn1負(fù)責(zé)降解[21],內(nèi)層由Eng1負(fù)責(zé)降解[22],這兩個(gè)降解酶都受到Ace2的調(diào)控。在Ace2轉(zhuǎn)錄途徑中,Mid2受 Ace2的調(diào)控,而 Mid2本身調(diào)控Septin(胞裂蛋白環(huán))的形成,因此它也參與了胞質(zhì)分裂過程。為了驗(yàn)證△sgf73的分裂缺陷是否由ace2+、mid2+的轉(zhuǎn)錄水平下降引起的,本研究在△sgf73中過量表達(dá)了sgf73+、ace2+、mid2+,回補(bǔ)結(jié)果顯示ace2+完全不能回補(bǔ)△sgf73的多隔膜表型,而mid2+也僅能部分回補(bǔ),提示缺失sgf73+還影響了其他調(diào)控胞質(zhì)分裂的途徑。另外,雖然△sgf73與△spt8所造成的多隔膜表型相似,但由于過量表達(dá)ace2+并不能回補(bǔ)△sgf73的表型缺陷,說明造成這兩者胞質(zhì)分裂缺陷的機(jī)制并不一致。

胞質(zhì)分裂是控制形成子細(xì)胞的重要生理過程,在高等生物中它的異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不正常分裂甚至誘發(fā)癌變。SAGA各亞基中除△spt8和△sgf73出現(xiàn)多膈膜表型外,最新的研究還發(fā)現(xiàn)△spt7、△spt20、△hfi1同樣呈現(xiàn)多隔膜表型[23]。針對(duì)這幾個(gè) SAGA亞基的缺失突變體菌株的分裂缺陷至今還未有深入的機(jī)制研究。SAGA是否可以直接與調(diào)控細(xì)胞周期或胞質(zhì)分裂的關(guān)鍵因子相互作用仍然不清楚。因此,闡明SAGA是僅僅通過轉(zhuǎn)錄的方式還是有其他途徑參與調(diào)控細(xì)胞周期或胞質(zhì)分裂是一個(gè)值得研究的問題,從而進(jìn)一步揭示SAGA的多功能性。

圖6 SAGA各亞基熒光菌株中缺失sgf73+后的細(xì)胞表型

圖7 sgf73突變體中過表達(dá)ace2+、mid2+、sgf73+后多隔膜細(xì)胞比例

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