宋輝,南志標(biāo)

蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,蘭州 730020

WRKY基因家族是一類只存在于植物的轉(zhuǎn)錄因子,主要參與植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[1]。WRKY通常含有長約60個氨基酸序列的保守區(qū)域,該區(qū)域內(nèi)一般含有保守的WRKYGQK七肽序列和緊隨其后的保守鋅指基序(Zinc finger motif)[2]。正是由于WRKYGQK保守七肽序列的存在,人們習(xí)慣上把含有這段保守序列的轉(zhuǎn)錄因子稱為 WRKY轉(zhuǎn)錄因子或WRKY基因[3]。目前的研究發(fā)現(xiàn),WRKY結(jié)構(gòu)域的C末端主要存在兩種不同類型的保守鋅指基序[4],即C-X4-5-C-X22-23-H-X-H(C2H2)和C-X5-8-CX25-28-H-X1-2-C(C2HC)。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和兩種不同類型的保守鋅指基序,一般將WRKY基因分為3種類型,即含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域的Ⅰ型基因、含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2基序(Motif)的Ⅱ型基因和含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域和C2HC基序的Ⅲ型基因[2]。另外,WRKY轉(zhuǎn)錄因子通常與目標(biāo)基因上游啟動子區(qū)域的順式作用元件W-box相結(jié)合起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用[2,3,5]。但是,有研究表明[6,7],WRKY轉(zhuǎn)錄因子還與SURE順式作用元件結(jié)合發(fā)揮作用,因此推測SURE可能是另一類與WRKY轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合的重要順式作用元件。

自 1994年 Ishiguro 和 Nakamura[8]從甘薯(Ipomoea batatasL.) 基因組中分離出WRKY基因的cDNA序列以來,研究者們相繼從擬南芥(Arabidopsis thaliana)[2,9]、馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)[10]、亞洲棉(Gossypium arboretumL.)[11]、水稻(Oryza sativaL.)[12]、大麥(Hordeum vulgareL.)[6]、小立碗蘚(Physcomitrella patens)[13]、楊樹(Populus tremula×Populus alba)[14]、向日葵(Helianthus annuusL.)[15]、黃瓜(Cucumis sativusL.)[16]和二穗短柄草(Brachypodium distachyonL.)[17]等植物基因組中鑒定出WRKY基因。在對這些WRKY基因進(jìn)行功能驗證的過程中,研究者們發(fā)現(xiàn)WRKY基因廣泛參與各種生理生化反應(yīng),包括生物脅迫和非生物脅迫以及植物的發(fā)育[1,2]。例如,當(dāng)植物受到傷害[18]、紫外線照射[19]、干旱、鹽害、低溫和高溫[20,21]以及病原菌侵染[22]等脅迫時,WRKY基因的表達(dá)量都會上調(diào)。同時,WRKY基因家族在植物種子發(fā)芽[23]、植株衰老[24]、休眠[25]等方面也具有重要的生理應(yīng)答。

既然WRKY基因家族參與如此多的調(diào)控,勢必要求WRKY原始基因在漫長的進(jìn)化過程中分化出不同功能的基因。基因重復(fù)(Gene duplication) 是植物在長期的進(jìn)化過程中逐步形成的一種機制,主要是通過基因不等交換、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座或全基因組重復(fù)等途徑產(chǎn)生一個與原基因相似的基因或堿基序列[26]?；驈?fù)制主要分為兩種形式,一種是串聯(lián)重復(fù)(Tandem duplication),一種是片段重復(fù)(Segmental duplication)。基因重復(fù)事件在基因擴張中具有重要的作用,尤其是串聯(lián)重復(fù),基因家族中一些不同功能的基因很有可能是由于串聯(lián)重復(fù)產(chǎn)生的[27]。例如,對大豆(Glycine maxL.)[28]和毛果楊(Populus trichocarpa)[29]WRKY基因家族進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn),其數(shù)量眾多的WRKY基因是通過串聯(lián)重復(fù)產(chǎn)生的。

蒺藜苜蓿(Medicago truncatulaL.)作為優(yōu)良的牧草在全世界范圍內(nèi)被廣泛地種植。由于其具有基因組較小、二倍體、自花授粉、易于轉(zhuǎn)化、再生時間較短等特點被作為豆科模式植物進(jìn)行研究[30]。本研究利用生物信息學(xué)方法對蒺藜苜蓿全基因組中的WRKY基因家族的基因重復(fù)、染色體定位、系統(tǒng)發(fā)生、保守基序和 EST表達(dá)模式等進(jìn)行分析,希望該研究結(jié)果能為以后在豆科植物的育種過程中提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 WRKY基因的鑒定

本研究以蒺藜苜蓿全基因組序列(Mt3.5v5) 為研究對象,基因組序列從蒺藜苜蓿公布測序結(jié)果的網(wǎng)站獲得(http://www.medicago.org)。將下載到的蒺藜苜蓿蛋白質(zhì)序列使用BLAST構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫,以Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.janelia.org) 中WRKY結(jié)構(gòu)域(PF03106)為查詢序列進(jìn)行BLAST搜索(P-value=10-3)[31,32]。利用 Clustal W 程序[33]對所確定的 WRKY序列進(jìn)行多序列比對(Multiple sequence alignment),手工去除冗余序列和不完整讀碼框的序列。使用Pfam數(shù)據(jù)庫對WRKY蛋白質(zhì)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域檢測,去除不含WRKY結(jié)構(gòu)域的序列。

1.2 WRKY基因的基因重復(fù)和染色體定位

利用本地 BLAST程序(P-value=10-10) 對蒺藜苜蓿WRKY基因家族進(jìn)行基因重復(fù)分析[31,34]?；蛑貜?fù)事件必須同時滿足以下條件[35]：(1) 在核苷酸序列比對區(qū)域中,相對短的核苷酸序列必須覆蓋相對長的核苷酸序列的70%以上;(2) 在氨基酸序列比對區(qū)域中,兩條氨基酸的相似度要達(dá)到70%以上。

蒺藜苜蓿WRKY基因在每條染色體上的定位信息由蒺藜苜蓿公布基因組序列網(wǎng)站中的 BLAST程序進(jìn)行確認(rèn),其染色體物理定位圖使用 MapInspect程序進(jìn)行繪制。

1.3 WRKY基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)分析

為了解蒺藜苜蓿WRKY基因的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,通過Clustal X程序[36]對蒺藜苜蓿WRKY結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對,使用 MEGA 4.0程序[37]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹采用鄰接法(NJ),Bootstrap值設(shè)置為1 000。

使用在線程序 PAL2NAL計算蒺藜苜蓿WRKYⅢ基因在進(jìn)化中的選擇壓力。如果Ka/Ks>1,表示基因經(jīng)受正選擇壓力;Ka/Ks=1,表示基因經(jīng)受中性選擇壓力;Ka/Ks<1,表示基因受純化選擇壓力。

先前的研究表明,WRKY結(jié)構(gòu)域中主要含有兩種不同類型的保守內(nèi)含子[2]。本研究采用在線程序GSDS分析蒺藜苜蓿WRKY結(jié)構(gòu)域的基因結(jié)構(gòu)。

1.4 WRKY基序分析

在線程序 MEME[38]可以很好的分析基因的基序。本研究將蒺藜苜蓿 WRKY蛋白質(zhì)序列提交到MEME網(wǎng)站預(yù)測WRKY基因的基序。在線程序MEME的參數(shù)設(shè)置為：(1) 基序重復(fù)的數(shù)量為“any”;(2) 基序的長度為6～200;(3) 預(yù)測基序的數(shù)量為20。

1.5 WRKY基因EST表達(dá)模式分析

為了預(yù)測蒺藜苜蓿WRKY基因的表達(dá)情況,本研究從NCBI網(wǎng)站的GenBank中下載了所有蒺藜苜蓿的EST序列。通過構(gòu)建蒺藜苜蓿EST本地數(shù)據(jù)庫,以蒺藜苜蓿WRKY基因為查詢序列進(jìn)行本地BLAST搜索(P-value=10-10)[34]。比對結(jié)果符合以下條件的被認(rèn)為是假定的EST表達(dá)模式(EST expression profile)：(1)在比對區(qū)域內(nèi),兩序列的相似度在 96%以上;(2)在比對區(qū)域內(nèi),核苷酸序列的長度在200 bp以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 WRKY基因的鑒定及分類

通過使用本地 BLAST程序?qū)疝架俎Ｈ蚪M進(jìn)行篩選,共分離到93條含有完整讀碼框的候選WRKY序列。經(jīng)過Pfam數(shù)據(jù)庫檢測發(fā)現(xiàn),這93條候選序列均含有 WRKY結(jié)構(gòu)域。但是,其中 12個WRKY結(jié)構(gòu)域中含不完整的WRKYGQK七肽序列或不完整的保守鋅指基序。因此,本文把這些基因定義為非標(biāo)準(zhǔn)WRKY類型基因。與此相對,其他的WRKY基因(81個) 定義為標(biāo)準(zhǔn)WRKY類型基因。

依據(jù)對WRKY基因分類的標(biāo)準(zhǔn)[2],本研究發(fā)現(xiàn),這93條候選序列中有20條序列含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域。其中,19個屬于標(biāo)準(zhǔn)WRKY基因,定義為Ⅰ型,1個含有非標(biāo)準(zhǔn)的WRKY結(jié)構(gòu)域。此外,其他73條候選序列均只含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域。其中,11個基因含有非標(biāo)準(zhǔn) WRKY結(jié)構(gòu)域,而另外 62個基因中有49個基因含有C2H2保守鋅指基序,13個含有C2HC保守鋅指基序,分別將其定義為Ⅱ型和Ⅲ型基因(表1,表 2)。

研究表明[2],Ⅱ型的WRKY基因可以細(xì)分為 5個亞組,即Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe。本文以已公布的擬南芥WRKYⅡ型基因作為參考序列與蒺藜苜蓿WRKYⅡ型基因共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,從而鑒別出蒺藜苜蓿WRKYⅡ型基因的5個亞組。由圖1可知,蒺藜苜蓿WRKY基因(MtWRKY) 包括6個Ⅱa、8個Ⅱb、19個Ⅱc、8個Ⅱd和8個Ⅱe,其中Ⅱc被分為Ⅱc1(5個) 和Ⅱc2(14個) 兩個分支。

表1 蒺藜苜蓿WRKY基因的特征

續(xù)表1

表2 7種植物中WRKY基因的分類和數(shù)目

2.2 WRKY的染色體定位和基因重復(fù)

蒺藜苜蓿93個WRKY基因在8條染色體上的物理定位信息見圖2。由于蒺藜苜?，F(xiàn)在尚未完成全基因組測序,所以有些基因暫時無法定位在具體的染色體上,本研究暫時將這些基因定位在假設(shè)的 0號染色體上。

由圖2可知,蒺藜苜蓿WRKY基因在染色體上呈不均等分布。其中7號染色體上所含的WRKY基因最多,多達(dá)18個,而6號染色體上分布的WRKY基因最少,僅有2個。值得注意的是,分布在1號染色體上的6個WRKY基因均為Ⅱ型。另外,6個WRKYⅡ型基因和1個WRKYⅢ型基因分布在8號染色體上。有研究表明[4],Ⅲ型的WRKY基因的起源晚于Ⅱ型的WRKY基因?；谶@種觀點,結(jié)合蒺藜苜蓿WRKY基因在8號染色體上的物理定位,推測WRKYⅢ型基因可能是由于Ⅱ型基因經(jīng)過基因突變而形成的。

根據(jù)Holub[39]對基因簇(Gene cluster) 的定義：在200 kb核苷酸序列區(qū)域內(nèi),含有3個或3個以上的基因定義為一個基因簇。最終,本研究在蒺藜苜蓿WRKY基因中發(fā)現(xiàn)了 6個基因簇共包括17個基因。其中,最大的一個基因簇含有5個基因分布在2號染色體上。此外,每個基因簇平均含有3.4個基因(表3)。

在蒺藜苜蓿WRKY基因中共檢測到11個基因復(fù)制事件,涉及24個基因,占全部WRKY基因的26%。其中,4個基因?qū)儆谄沃貜?fù),20個基因?qū)儆诖?lián)重復(fù)(圖2,表3)。另外,單基因占全部基因的74%,表明在蒺藜苜蓿中這些WRKY基因的形成可能主要不是依賴基因重復(fù)完成的。

2.3 蒺藜苜蓿WRKY結(jié)構(gòu)域多重比對分析

分別對蒺藜苜蓿3種類型的WRKY結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對,結(jié)果顯示,除了Ⅰc、Ⅱc和Ⅱd型的結(jié)構(gòu)域在 WRKYGQK七肽序列結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)多樣性之外,其他類型的 WRKY結(jié)構(gòu)域均含有一致序列WRKYGQK。其中,在Ⅰc型結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn) Q突變成 R,形成 WRKYGRK七肽序列; 而在Ⅱd型結(jié)構(gòu)域中Q突變成S,形成WRKYGSK七肽序列。除此之外,在Ⅱc型結(jié)構(gòu)域中WRKYGQK七肽序列的一致性最差,該序列分別突變成以下 6種類型,即WKKYGEE、WRKYGEQ、WRKYGEK、WRKYGKK、WKKYEEK 和 WLKYDRK(圖 3)。

眾所周知,在WRKY結(jié)構(gòu)域中除了含有保守的七肽序列WRKYGQK之外,在該七肽序列之后還包括一個保守的鋅指基序(C2H2或者 C2HC)[2]。本研究結(jié)果表明,只有在Ⅲ型的 WRKY結(jié)構(gòu)域中存在C2HC基序,在其他類型的 WRKY結(jié)構(gòu)域中只含有C2H2基序。該結(jié)果與之前對水稻的研究結(jié)果略有不同,在水稻中發(fā)現(xiàn)個別In型的氨基酸序列中除了含有 C2H2之外還具有C2HC基序[12,40]。這或許與不同植物中該類型基因發(fā)揮不同的作用有關(guān)系。

2.4 蒺藜苜蓿WRKY基因系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析

蒺藜苜蓿WRKY基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖 4a),雖然系統(tǒng)發(fā)育樹中有些自舉值(Bootstrap) 偏低,但是系統(tǒng)發(fā)育樹根據(jù) WRKY結(jié)構(gòu)域的分類可以明顯的分為 6個分支,這說明此系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本正確。其中,Ⅰn和Ⅰc分支分別是Ⅰ型WRKY結(jié)構(gòu)域兩種類型的聚類(n表示多肽鏈N端的WRKY結(jié)構(gòu)域,c表示多肽鏈C端的WRKY結(jié)構(gòu)域),Ⅱ型結(jié)構(gòu)域分別在Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe分支上。此外,Ⅲ型的成員比較保守,全部分布在Ⅲ分支上(圖4a)。

圖1 擬南芥與蒺藜苜蓿WRKY結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2 蒺藜苜蓿WRKY基因在染色體上的定位信息

表3 蒺藜苜?；蚪M中WRKY基因的組成

Zhang等[4]通過研究 5種植物WRKY基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系發(fā)現(xiàn),Ⅱa和Ⅱb聚集在一個大分支上,而Ⅱd和Ⅱe聚集在另一個大分支上。這個結(jié)果與本文分析蒺藜苜蓿 WRKY結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹相同。此外,本研究中Ⅱc與Ⅰc聚集在一個大分支上,甚至有一個Ⅱc型的基因(MtWRKY4) 聚集在Ⅰc分支上(圖4a),這表明它們可能有共同的起源。但是,也有部分Ⅱc型的基因(MtWRKY2、29、53和60) 并沒有聚集在Ⅱc分支上。其中,MtWRKY2、29和60聚集在Ⅰn分支上,而MtWRKY60聚集在Ⅱd和Ⅱe的大分支上(圖4a),這表明Ⅱc型的基因可能存在不同的起源。

2.5 蒺藜苜蓿WRKY結(jié)構(gòu)域基因結(jié)構(gòu)分析

圖3 蒺藜苜蓿WRKY結(jié)構(gòu)域的氨基酸多序列比對

蒺藜苜蓿 WRKY結(jié)構(gòu)域的基因結(jié)構(gòu)主要分為兩種類型：一種含有內(nèi)含子,另一種不含內(nèi)含子。由圖4b可知,在系統(tǒng)進(jìn)化樹中聚集在Ⅰn的WRKY結(jié)構(gòu)域均不含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu),這進(jìn)一步支持了作為Ⅱc型的MtWRKY2、29 和60基因聚集在Ⅰn的結(jié)果。此外,雖然其他WRKY結(jié)構(gòu)域含有不同長度的內(nèi)含子,但是,根據(jù)內(nèi)含子的類型可將其分為兩大類。其中,Ⅱa和Ⅱb型的WRKY結(jié)構(gòu)域具有同一個保守的內(nèi)含子結(jié)構(gòu),而Ⅰc、Ⅱc、Ⅱe和Ⅲ擁有另外一種類型的保守內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(圖 4b)。但是,在Ⅱe中,MtWRKY9 卻不含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu),這可能是由于其 WRKY結(jié)構(gòu)域中的內(nèi)含子在進(jìn)化過程中丟失造成的。

2.6 蒺藜苜蓿WRKYⅢ類型基因選擇壓力分析

WRKY基因家族中Ⅲ型基因被認(rèn)為是這3種類型的基因中最“年輕”的成員。為了檢測哪種選擇壓力影響了蒺藜苜蓿WRKY基因家族中Ⅲ型基因的產(chǎn)生,本文對這些基因分別進(jìn)行了同義替換率(Ka)和非同義替換率(Ks) 的計算。由圖5可知,Ka/Ks<1,表示蒺藜苜蓿WRKY基因家族中Ⅲ型基因的進(jìn)化經(jīng)受純化選擇壓力。由此可知,Ⅲ型的基因在結(jié)構(gòu)上比較保守。

2.7 WRKY保守基序分析

通過對81個標(biāo)準(zhǔn)WRKY基序預(yù)測的結(jié)果顯示,每一個類型的 WRKY所包含基序的類型各不相同(圖6,表4)。通過使用pfam數(shù)據(jù)庫檢測這些基序的功能發(fā)現(xiàn),只有motif1～6是WRKY結(jié)構(gòu)域的組成部分,而其他的基序在數(shù)據(jù)庫中暫無功能記錄。進(jìn)一步分析這些基序發(fā)現(xiàn),在Ⅰn和Ⅰc型氨基酸序列中,含有WRKYGQK七肽序列的基序(motif1或motif2)兩側(cè)的基序的類型各不相同。這表明,雖然Ⅰ型氨基酸序列中存在兩個WRKY結(jié)構(gòu)域,但它們在起源或功能分化上可能完全不同。另外,雖然Ⅱa-e隸屬于Ⅱ型基因的 5個亞型,但是每一個亞型的基序數(shù)量卻不相同。例如,在Ⅱa和Ⅱb中均含有較多的基序,而Ⅱc和Ⅱe中卻含有較少的基序(圖6)。值得注意的是,在Ⅲ型氨基酸序列中存在一個有趣的現(xiàn)象,MtWRKY22、23、24和75這4個基因中的N末端和C末端分別存在一個相同的基序(motif20)。這種結(jié)構(gòu)在其他類型的WRKY中尚未發(fā)現(xiàn),這可能在功能域發(fā)揮作用時具有重要作用。

2.8 WRKY基因EST表達(dá)模式的分析

圖4 蒺藜苜蓿中WRKY基因的系統(tǒng)發(fā)育樹和基因結(jié)構(gòu)

圖5 WRKY基因家族中Ⅲ類型Ka/Ks與Ka的關(guān)系

表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressing sequence tag,EST)被認(rèn)為是一種研究基因表達(dá)模式最為有效的方法[41]。本文從GenBank中下載了全部250 000條蒺藜苜蓿的EST序列。通過使用蒺藜苜蓿93個WRKY基因與這些EST進(jìn)行比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn),有60個WRKY基因在EST數(shù)據(jù)庫的種子、芽、莖、腺毛、葉、根、組培細(xì)胞和組織或器官中找到了支持的表達(dá)模式(表5)。其中,WRKY基因與組織或器官中EST相匹配的表達(dá)模式最多,多達(dá)51個,而在種子的EST中只檢測到3個相匹配的WRKY基因。值得注意的是,此處的組織或器官可能包括種子、芽、莖、腺毛、葉、根和組培細(xì)胞,但還可能包括未列出的組織或器官,如花等。此外,在這60個有表達(dá)模式的WRKY基因中,包含Ⅱ型的基因最多,高達(dá) 32個(53%),其次是15個( 25%)Ⅰ型的基因,再次是7個(12%)非標(biāo)準(zhǔn)的基因,而Ⅲ型的基因最少,只有 6個(10%)。這 3種類型的基因在 EST表達(dá)模式中所占的比例與這3種類型的基因在WRKY基因中所占的比例基本一致,這表明,在蒺藜苜蓿中,Ⅱ型的WRKY基因可能在植物體內(nèi)生理生化反應(yīng)過程中起主要作用。

3 討 論

隨著分子生物學(xué)尤其是測序技術(shù)的不斷發(fā)展,越來越多的植物完成了全基因組序列的測定,如擬南芥[42]、水稻[43]和大豆[27]等。2011年,研究人員公布了作為主要豆科牧草的蒺藜苜蓿全基因組序列(Mt3.5v5) 的草圖[30],這為人們從基因組水平上研究蒺藜苜蓿和進(jìn)行分子育種提供了便利條件。

表4 蒺藜苜蓿中預(yù)測的WRKY基序的一致序列

圖6 蒺藜苜蓿WRKY中預(yù)測的基序

本研究最終從蒺藜苜?；蚪M中鑒定出 81個標(biāo)準(zhǔn)的WRKY基因。與其他植物相比較發(fā)現(xiàn),植物基因組所含有WRKY基因的多少并不與其基因組的大小呈正比例關(guān)系。例如,葡萄(Vitis viniferaL.)的基因組大小為487 Mb,含有55個WRKY基因; 但是在蒺藜苜蓿 375 Mb的基因組中卻分布有 81個WRKY基因; 而從二穗短柄草 272 Mb的基因組中共鑒定出86個WRKY基因(表2)。

基因重復(fù)事件是基因擴張的主要原因之一。在對水稻W(wǎng)RKY基因家族的研究中發(fā)現(xiàn),80%的WRKY基因是由基因重復(fù)而來[44]。但是,本研究對蒺藜苜蓿WRKY基因家族的研究發(fā)現(xiàn),只有24個WRKY基因發(fā)生了基因重復(fù),僅占全部WRKY基因的26%,這個比例遠(yuǎn)低于水稻中發(fā)生基因重復(fù)的比率。我們推測,蒺藜苜蓿中WRKY基因家族出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因可能有以下3點：(1) 蒺藜苜蓿尚未完成全基因組序列的測定,因此,許多基因重復(fù)事件還無法進(jìn)行檢測;(2) 蒺藜苜蓿WRKY基因家族的成員可能不是通過基因重復(fù)事件進(jìn)行擴張的。在對黃瓜的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),黃瓜WRKY基因家族中沒有發(fā)現(xiàn)基因重復(fù)事件[16]。因此,在蒺藜苜蓿WRKY基因家族中可能僅存在低頻率的基因重復(fù)事件;(3) 在面對各種生物和非生物脅迫過程時,蒺藜苜蓿WRKY基因家族為了降低能量的消耗,可能自行“消滅”體內(nèi)冗余而沒有功能的WRKY基因,基于這種保護(hù)體制可能使自身獲得更有利的相對適合度。同樣,在漫長的進(jìn)化歷史中,蒺藜苜?？梢皂樌拇婊畹浆F(xiàn)在也表明其體內(nèi)數(shù)量有限的WRKY基因足夠應(yīng)付各種生物和非生物脅迫。

表5 WRKY基因的表達(dá)模式分析

(續(xù)表5)

另外,蒺藜苜蓿WRKY基因在染色體上的物理定位的研究表明,WRKY基因在蒺藜苜蓿染色體上呈不均勻分布。但是,在對水稻[40]和毛果楊[29]的研究已經(jīng)證實,WRKY基因主要分別集中在水稻的1號染色體和毛果楊的14號染色體上。這表明在水稻和毛果楊中這兩條染色體上可能發(fā)生了高頻率的基因重復(fù)事件。

通過分析蒺藜苜蓿 WRKY結(jié)構(gòu)域的基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),蒺藜苜蓿WRKY結(jié)構(gòu)域含有保守的內(nèi)含子。2005年,Wu等[9]對水稻W(wǎng)RKY結(jié)構(gòu)域研究發(fā)現(xiàn),在Ⅰc、Ⅱc-e和Ⅲ型的結(jié)構(gòu)域中,鋅指結(jié)構(gòu)第一個 C前面第5個氨基酸殘基處(R) 是內(nèi)含子的插入位點,并將這種內(nèi)含子命名為R類型內(nèi)含子,然而,在Ⅱa和Ⅱb型的結(jié)構(gòu)域中,內(nèi)含子的插入位點在鋅指結(jié)構(gòu)第2個C后的第6個氨基酸殘基處(V),將其命名為V類型的內(nèi)含子。但是,Ⅱa和Ⅱb型結(jié)構(gòu)域中內(nèi)含子的插入位點存在另外一種發(fā)現(xiàn)。在擬南芥和黃瓜的研究中發(fā)現(xiàn)[2,16],Ⅱa和Ⅱb型結(jié)構(gòu)域內(nèi)含子的插入位點位于鋅指結(jié)構(gòu)第2個C后的第4個氨基酸殘基處(K)。本文對蒺藜苜蓿WRKY結(jié)構(gòu)域的研究結(jié)果與在水稻中的研究結(jié)果一致(圖 3)。對于這種保守內(nèi)含子在 WRKY結(jié)構(gòu)域不同位點的插入是否對WRKY基因的功能造成不同影響的研究尚未見報道。WRKY基因家族成員在調(diào)節(jié)植物體生理生化作用時各有分工,因此,保守內(nèi)含子在WRKY結(jié)構(gòu)域不同位點的插入是否影響WRKY基因的功能,可能是下一步研究的熱點。

WRKY基因家族依據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的不同可以分為3種類型。目前研究者普遍認(rèn)為[2,4],Ⅱ和Ⅲ型的WRKY結(jié)構(gòu)域起源于Ⅰ型C端的結(jié)構(gòu)域。Ⅱ型的C2H2保守鋅指結(jié)構(gòu)基序中的組氨酸(H) 被半胱氨酸(C) 替換后形成Ⅲ型中的C2HC保守鋅指結(jié)構(gòu)基序[40]。但是,本文在分析WRKY基序時發(fā)現(xiàn),有些Ⅱ或Ⅲ型的結(jié)構(gòu)域可能起源于Ⅰ型N端的結(jié)構(gòu)域。例如,Ⅰ型N端3個基序(motif3,5和6) 出現(xiàn)在Ⅱ(MtWRKY2、29、60、88、89和 90) 和Ⅲ(MtWRKY 21、22、23、24、25、59、75、76 和 87) 型的基因中,而且更為重要的是在這些Ⅱ和Ⅲ型的基因中沒有出現(xiàn)Ⅰ類型C端的結(jié)構(gòu)域(圖6,表4)。

更為有趣的是,在研究擬南芥WRKY結(jié)構(gòu)域時發(fā)現(xiàn),擬南芥Ⅲ型AtWRKY52/RRS1基因的WRKY結(jié)構(gòu)域的 C末端含有 TIR-NBS-LRR基因(Toll/interleukin-receptor-nucleotide-binding site-leucine-rich repeat) 的結(jié)構(gòu)域,而 TIR-NBS-LRR基因被證實參與植物對病原菌的免疫反應(yīng)過程[45]。但是,本研究并沒有發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。為了嘗試解釋這種區(qū)別,本文一方面研究了蒺藜苜蓿WRKYⅢ型基因在進(jìn)化過程中所受選擇壓力對基因進(jìn)化的影響。通過計算Ka/Ks發(fā)現(xiàn),蒺藜苜蓿Ⅲ型的WRKY基因在進(jìn)化的過程中受純化選擇。這個結(jié)果與在黃瓜中的研究結(jié)果一致[16]。但是,在擬南芥中卻發(fā)現(xiàn),正選擇壓力在Ⅲ型基因的進(jìn)化過程中起主導(dǎo)作用[16]。一般情況下,正選擇壓力更有益于基因的擴張或功能的分化,而純化選擇壓力往往使基因變的更保守。因此,不難得出,在擬南芥中發(fā)生兩種結(jié)構(gòu)域的融合可能正是由于正選擇壓力的結(jié)果,相反,在蒺藜苜?；螯S瓜中,“消極”的純凈化選擇壓力沒有給該基因一個自我發(fā)展的機會,反而使該基因變的越來越保守。

另一方面,本文推測,相比與蒺藜苜蓿或黃瓜,擬南芥在生長周期中可能經(jīng)歷更多的病害。這勢必要求在擬南芥中,抗病的基因在抵御病原菌的侵染過程中發(fā)揮更為重要的作用。由于病原菌的不斷變異,同樣會使抗病基因在結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生相應(yīng)的變化,最終抗病基因與病原菌形成了協(xié)同進(jìn)化,或許WRKYⅢ型的基因與 TIR-NBS-LRR基因的融合正是為了增強自身的抗病能力以適應(yīng)不斷變異的病原菌。

本研究利用EST序列分析了蒺藜苜蓿WRKY基因在生物和非生物脅迫下的表達(dá)模式,結(jié)果顯示W(wǎng)RKY基因在蒺藜苜蓿體內(nèi)具有廣泛的表達(dá),在組織或器官中的表達(dá)量最大,而在種子中的表達(dá)量最少,這可能與組織或器官經(jīng)受比較多的脅迫而種子經(jīng)受的脅迫比較少有關(guān)。但是,有報道證實,WRKY基因與種子發(fā)育有密切關(guān)系[22,46]。因此,本文推測,種子中的WRKY基因更傾向參與種子發(fā)芽的調(diào)控。

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