李雪芳 亓建洪 宋洪強

泰山醫(yī)學院運動醫(yī)學研究所，山東泰安 271000

影響體外組織培養(yǎng)保存關(guān)節(jié)軟骨活性的因素

李雪芳 亓建洪 宋洪強▲

泰山醫(yī)學院運動醫(yī)學研究所，山東泰安 271000

體外培養(yǎng)保存的關(guān)節(jié)軟骨組織是關(guān)節(jié)軟骨移植材料重要來源。但是由于保存時間偏短的弊端限制了其臨床應用。軟骨組織從相應的供體取出后如何在體外保存，在保存過程中又有哪些因素影響軟骨細胞的存活率是眾多學者一直研究的問題。本文從影響體外培養(yǎng)保存軟骨組織活性的Wnt/β-catenin信號通路、癌基因、應力、細胞因子、中藥等因素入手，系統(tǒng)地分析了影響體外組織培養(yǎng)保存關(guān)節(jié)軟骨活性的因素，以期為軟骨保存方法的下一步改良提供參考依據(jù)。

關(guān)節(jié)軟骨；Wnt/β-catenin信號通路；癌基因；應力；細胞因子；中藥

隨著現(xiàn)代經(jīng)濟水平的發(fā)展以及人們運動意識的增強，各種原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)軟骨損傷患者數(shù)量迅猛增加。目前同種異體軟骨移植技術(shù)是治療該損傷的理想方法之一，該技術(shù)分為自體和異體移植。自體移植的軟骨來源有限，給患者造成再次損傷，所以應用較少。異體組織移植能很好的解決這個問題，但異體軟骨組織在體外如何保持良好的活性進而保障較高的植入存活率一直是困擾的難題。由于影響因素眾多，本文從典型的內(nèi)部機制及外部作用因素進行綜述。

1 Wnt細胞信號通路對軟骨組織體外保存活性的影響

Wnt信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的對細胞發(fā)生發(fā)展有異常作用的通路，可分為經(jīng)典通路（Wnt/β-catenin通路）和非經(jīng)典通路（Wnt/PCP信號通路、Wnt/Ca2+通路）。本文主要分析經(jīng)典通路對體外保存軟骨組織活性的影響。研究顯示，Wnt/β-catenin通路是軟骨發(fā)育、關(guān)節(jié)形成的重要調(diào)控機制。經(jīng)典信號通路主要由以下部分組成：β-catenin、糖原合酶激酶3β（GSK-3β）、軸蛋白（axin）、APC（adenomatous polypo siscoli）、胞質(zhì)內(nèi)Disheveled（DSH）蛋白、酪蛋白激酶α（CKlα）等，其中axin、APC、GSK-3β、CKⅠα組成的復合體可以調(diào)切細胞內(nèi)的β-catenin水平，具體作用機制是DSH發(fā)生磷酸化后向細胞膜聚集，與axin、APC、GSK-3β、CKⅠα組成的復合體相結(jié)合，F(xiàn)rat1/GBP通過胞質(zhì)內(nèi) DSH蛋白進入該復合體，與axin競爭結(jié)合GSK-3β，進而阻斷β-catenin的降解?？偟膩碚f，經(jīng)典的信號通路可以概括為：跨膜受體Frizzled蛋白（Frz蛋白）與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5和6（LRP5/6）組成的共同受體，可與Wnt蛋白相結(jié)合，進而激活Wnt/ β-catenin信號途徑。近年來許多研究通過在培養(yǎng)液中添加一些特定的因子激活或者抑制Wnt/β-catenin信號通路后，觀察Wnt/β-catenin信號通路變化對軟骨組織體外保存的影響，如Wnt/β-catenin通路與HMGB2相互作用可以維持軟骨表淺區(qū)的穩(wěn)定，HMGB2可以使LEB-1-β-catenin復合體的活性增強，進而拮抗β-catenin作用，促進軟骨細胞的存活[1]；SFRP5（secreted frizzled related protein-5）是Wnt分子的拮抗劑，通過對大鼠的FRZB或SFRPS抑制實驗發(fā)現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)軟骨細胞中MMPs活性增強，蛋白聚糖減少[2]；還有研究表明通過添加Wnt分子抑制劑DKK-1可以減緩軟骨病變[3]。

Wnt信號通路對體外保存軟骨組織活性的作用是多方面的，既有促進軟骨發(fā)育的一面，又有促進軟骨老化、誘發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎的一面，但其具體原因尚不明確，目前對Wnt信號通路的研究報道甚少。Wnt信號通路是控制軟骨組織體外保存活性的新突破，對其做深入研究有重要意義。

2 癌基因?qū)浌墙M織體外保存的影響

軟骨組織體外保存的良好活性依賴于各相關(guān)基因之間的平衡。

2.1 p53基因

p53基因與人類腫瘤的相關(guān)性最高，可分為野生型和突變型，其中野生型p53可誘導關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡，在凋亡細胞中表達陽性，是細胞周期和DNA修復的重要調(diào)節(jié)因子，并且還可以限制細胞的生長，在細胞凋亡過程中起關(guān)鍵信號作用[4]。

2.2 Bcl-2基因家族

目前記載的Bcl-2家族成員最少有25個，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同分為促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bad、Bik等）和抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等）。研究顯示，Bcl-2家族主要位于細胞的線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等相關(guān)部位，其作用機制是通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，影響膜電位和細胞色素C的釋放，通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)Ca2+濃度來影響細胞的活性[5]。Bcl-2基因主要在18號染色體上，具有抑制細胞凋亡和延長細胞壽命的功能[6]。Bcl-2家族均含有一種以上共有的同源結(jié)構(gòu)域（Bcl-2 homology，BH），分別為BH1、BH2、BH3、BH4，其家族成員可借此結(jié)構(gòu)域形成同源或異源性二聚體。軟骨細胞的存活和二聚體之間的平衡相關(guān)，Bax過量，形成Bax二聚體，細胞趨于凋亡；Bcl-2過量，形成Bcl-2二聚體，細胞趨于存活。另外，Bax和Bcl-2也能形成二聚體，Bax/Bcl-2比值升高則抑制細胞凋亡，反之則促進細胞凋亡，所以Bcl-2和Bax共同調(diào)節(jié)了軟骨細胞的凋亡[7]。

2.3 c-myc基因

近年來通過對療程性細胞死亡的研究，發(fā)現(xiàn)c-myc基因的表達失調(diào)會導致多種細胞凋零，細胞凋零的發(fā)生速度及對誘導因素的敏感性都和細胞內(nèi)myc蛋白含量有關(guān)。人類c-myc基因主要存在于第8對染色體上，它的表達產(chǎn)物是含有439個氨基酸的蛋白質(zhì)。一些研究顯示c-myc在凋亡的軟骨細胞核中有少量表達，并且c-myc參與OA患者軟骨細胞凋亡的全過程，其具體機制是c-myc通過參與轉(zhuǎn)錄對軟骨細胞的存活產(chǎn)生影響。Hiyama等[8]研究發(fā)現(xiàn)，c-myc所需細胞增殖的關(guān)鍵蛋白的表達是通過Wnt信號傳導調(diào)節(jié)，研究還發(fā)現(xiàn)，通過氯化鋰激活Wnt信號會導致c-myc的啟動子活性和表達的抑制，結(jié)果表明，c-myc是促進細胞增殖的重要因素。

2.4 ICE基因家族

ICE基因家族是半胱氨酸轉(zhuǎn)化酶的一種，因與ced-3同源，所以被統(tǒng)一命名為半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase），有人將Caspase稱為ICE家族，ICE為Caspase-1，目前已發(fā)現(xiàn)的Caspases至少有14種[9]。Caspase家族的相關(guān)成員在細胞凋亡以及信號傳導過程中發(fā)揮著重要作用，當它們活化后可激活DNA內(nèi)切酶，使DNA發(fā)生片段化和凋亡。

3 應力變化對軟骨組織體外保存的影響

軟骨組織在正常生理環(huán)境下靠周期性應力產(chǎn)生的形變（抽吸作用）吸取關(guān)節(jié)液中的營養(yǎng)，這也是軟骨組織唯一的營養(yǎng)攝取途徑[10]。Klein等[11]發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨組織各層的受力特性并不同，軟骨細胞可根據(jù)受力程度的不同分為三層，表層軟骨細胞密度高，為扁盤凹狀，極化明顯排列于軟骨的表面，主要以抗剪切力為主；中層密度中等，相對稀疏，為圓形，以抗壓力為主；深層細胞密度最小，呈柱狀并以潮線為基線排列，深層對前兩者均有一定的抗性；最下層是軟骨下骨[12]。不同性質(zhì)的力學刺激對軟骨組織的影響不同，當應力較小時深層軟骨細胞比表、中層細胞發(fā)生的形變更大，這種變化主要體現(xiàn)在細胞的寬度，當應力較大時（＞0.2 MPa），中層細胞發(fā)生的形變是最大的[13]。大量的研究資料證實生物力學可對關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生積極影響[14-18]，但也有相反的報道。目前對于應力刺激如何影響軟骨組織的確切機制還不清楚，有待進一步研究。

4 細胞因子對軟骨組織體外保存的影響

研究顯示多種細胞因子如白細胞介素（IL）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β、胰島素樣生長因子（IGF）-Ⅰ、腫瘤壞死因子（TNF）等對軟骨修復有著不可忽視的作用。

4.1白細胞介素

IL是一組由多種類型細胞所分泌的結(jié)構(gòu)和功能各異的可溶性蛋白，根據(jù)其對軟骨修復的影響，大致可分為促炎因子（主要為IL-1、IL-11、IL-17和IL-18等）、抗炎因子（主要為IL-4、IL-10和IL-13等）和調(diào)節(jié)因子（主要為IL-6和IL-8）。其中IL-1可抑制軟骨細胞增殖，使軟骨細胞外基質(zhì)蛋白多糖合成減少，細胞釋放炎性因子（如IL-6、17、18）增加，并可與軟骨細胞表型分化相關(guān)的基因發(fā)生作用[19]。IL-1尚可以誘導軟骨細胞凋亡，加重關(guān)節(jié)軟骨破壞程度。Jikko等[20]報道，調(diào)節(jié)因子IL-6也可以抑制軟骨細胞的增殖和蛋白多糖的合成。

4.2轉(zhuǎn)化生長因子-β

TGF-β參與細胞生長和細胞外基質(zhì)合成等相關(guān)過程。哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)的亞型有TGF1、2、3，幾乎體內(nèi)的每個細胞都產(chǎn)生TGF并存在其受體。TGF-β在細胞增生、修復創(chuàng)傷，細胞外基質(zhì)形成，骨的重建等方面有著重要作用，還可以抑制炎性介質(zhì)（IL-1、IL-6，TNF-α等）的活性和免疫反應等，對軟骨細胞的作用是雙向的[21]。

4.3胰島素樣生長因子

IGF-Ⅰ是最早被證實對關(guān)節(jié)軟骨具有促進合成代謝作用的生長因子之一。IGF-Ⅰ與軟骨細胞膜上的IGF-Ⅰ受體結(jié)合，以旁分泌和自分泌方式起作用，從而刺激軟骨細胞的增殖，是軟骨細胞基質(zhì)合成及基質(zhì)結(jié)合蛋白合成的有效刺激劑。IGF-Ⅰ還有促進軟骨細胞形成軟骨組織的作用。

4.4腫瘤壞死因子

1975年Carswell等研究發(fā)現(xiàn)，給接種過卡介苗的老鼠注射細菌脂多糖后，血清中會出現(xiàn)一種使多種腫瘤產(chǎn)生出血性壞死的物質(zhì)，從而將它命名TNF。1985年Shalaby將TNF命名為TNF-α和TNF-β兩類，其中TNF-α為促炎細胞因子，作用機制與IL-1類似，是參與軟骨基質(zhì)降解的重要介質(zhì)，通過上調(diào)MMP的基因表達發(fā)揮作用，還可以減少膠原和蛋白多糖的生成[22]，使關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)發(fā)生降解，進而影響軟骨細胞的存活。

5 中醫(yī)中藥對軟骨組織體外保存的影響

近年來中醫(yī)中藥對軟骨組織體外保存的研究成為了熱點，但關(guān)于其具體機制及何種藥物能促進或抑制軟骨組織體外保存活性的研究甚少。國內(nèi)有研究中藥蛇床子對軟骨細胞增殖作用影響的實驗，明磊國等[23]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度蛇床子素抑制成骨細胞生長，低濃度對生長無影響，但可以促進成骨。也有研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸多肽對OA過程中發(fā)生的軟骨細胞凋亡有抑制作用，可以降低關(guān)節(jié)液中的TNF-α 和IL-1β，在某些程度上延緩了關(guān)節(jié)軟骨的退變[24]。李西海等[25]研究顯示，獨活寄生湯可通過影響神經(jīng)-內(nèi)分泌-骨代謝系統(tǒng)、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)和抑制軟骨凋亡的信號通路，參與調(diào)控軟骨下骨及軟骨的功能，延緩軟骨病變。中藥成分對軟骨組織體外保存的研究是一個新興的課題，其作用機制研究尚淺，如何選用中藥成分保持軟骨組織較高活性需要更多學者繼續(xù)努力。

6 結(jié)束語

以上資料提示軟骨組織體外保存活性受多種因素的影響，目前對較為熱點的Wnt/β-catenin信號通路研究較少，該通路的變化對軟骨組織活性的影響有待進一步研究，而對其他相關(guān)基因、應力、細胞因子等影響因素的研究越來越深入。中醫(yī)中藥對軟骨組織活性調(diào)控的研究目前尚屬起步階段，但有越來越多的人員開始關(guān)注這一方面。軟骨組織的體外保存培養(yǎng)還需要深入研究，相信在不久的將來，軟骨損傷將不再是困擾人們的一個難題。

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隨著時代的發(fā)展，無線網(wǎng)絡通信技術(shù)的應用范圍更加廣泛，這也給無線網(wǎng)絡環(huán)境的安全提出了更高的要求。當前無線網(wǎng)絡通信中采用的安全技術(shù)主要包括WPKI技術(shù)和IBC技術(shù)兩種。其中WPKI技術(shù)是在有線網(wǎng)絡PKI基礎(chǔ)上建立起來的，只對無線通信網(wǎng)絡中的無線環(huán)境部分進行了改進，所以WPKI技術(shù)在無線網(wǎng)絡通信環(huán)境中的應用局限性較大。而BIC則結(jié)合了無線網(wǎng)絡通信技術(shù)的特點，是一項專門針對無線網(wǎng)絡環(huán)境的安全技術(shù)。因此，未來無線網(wǎng)絡通信安全技術(shù)的發(fā)展也必將以IBC技術(shù)為主。

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The factors affecting in vitro tissue culture preservation activity of articular cartilage

LI Xue-fang QI Jian-hong SONG Hong-qiang▲
Sports Medicine Institute of Taishan Medical College,Taian 271000,China

Articular cartilage of vitro tissue culture preservation is an important source of articular cartilage graft material.However,storage time is too short to apply in clinica.Many scholars have always researched that how to preserve the cartilage removed from the donor and what factors influence the chondrocytes survival during tussue culture in vitro.This article systemically analyzes the factors affecting of preservation activity of tissue culture articular cartilage,including Wnt/β-catenin signaling pathway,cytokines,oncogenes,stress,chinese medicine and so on.It hopes to provide a good reference for the improvement of cartilage preservation methods.

Articular cartilage;Wnt/β-catenin signaling pathway;Oncogene;Stress;Cytokines;Chinese medicine

R322.7+1

A

1674-4721（2014）010（a）-0194-03

2014-08-15本文編輯：祁海文）

山東省自然科學基金（ZR2012HL22）；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（2011HW082）

李雪芳（1985-），女，2011級在讀碩士研究生

▲通訊作者：宋洪強（1977-），男，碩士，講師，主要研究方向：關(guān)節(jié)軟骨損傷與康復